多點(diǎn)穿刺灌流法分離成人肝細(xì)胞及其體外功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、人工肝支持系統(tǒng)是目前公認(rèn)治療各種急性肝功能衰竭的最有效方法，以肝細(xì)胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL）更是未來治療各種急慢性肝病的希望所在。生物型人工肝以體外培養(yǎng)的具有生物活性的肝細(xì)胞為主要構(gòu)成，因而具有類似肝的解毒、分泌、合成及轉(zhuǎn)化等功能，其核心部分便是執(zhí)行肝功能的肝細(xì)胞。 隨著近代細(xì)胞工程學(xué)的進(jìn)展，細(xì)胞生物學(xué)、組織培養(yǎng)技術(shù)、生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，肝細(xì)胞作為構(gòu)建生物人工肝的生物部分，作為細(xì)胞

2、移植治療急慢性肝衰竭的種子細(xì)胞以及作為藥物篩選的靶細(xì)胞，成為目前研究的熱點(diǎn)。而制備和培養(yǎng)高活力的肝細(xì)胞，尤其是人肝細(xì)胞的制備，正是這些研究的最基本環(huán)節(jié)。 肝細(xì)胞分離方法有多種：機(jī)械分離法、鰲合法和酶消化法等。最初的機(jī)械分離法始于半個(gè)多世紀(jì)前，1956年Sorrentino第一次用機(jī)械的方法分離新鮮肝組織制成勻漿，并在體外進(jìn)行藥物解毒試驗(yàn)，但機(jī)械分離法獲得的肝細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量少、活性差，逐漸被棄用。1967年Howard創(chuàng)建了膠原酶

3、灌流法，1972年Seglen進(jìn)一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法，即首先灌注預(yù)熱的無鈣平衡鹽溶液去除肝血竇內(nèi)的血細(xì)胞及部分非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，然后再灌注含有膠原酶的平衡鹽溶液，進(jìn)行體外消化后，分離提純而獲得肝細(xì)胞。用此法獲得的肝細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量和活性都得到了提高，而且減少了肝細(xì)胞懸液中的雜質(zhì)。膠原酶二步灌流法已成為目前實(shí)驗(yàn)室分離肝細(xì)胞的常用方法。 二步灌流法廣泛應(yīng)用于中小型動(dòng)物如小鼠、大鼠、兔和犬等動(dòng)物肝臟的分離。目前，人肝細(xì)胞的分離也主要

4、應(yīng)用肝移植手術(shù)中因配型不合而丟棄的供肝進(jìn)行膠原酶二步灌流分離，但此方法的明顯不足在于肝移植的供肝極為緊張，而因配型不合丟棄的供肝更是稀缺，完全無法滿足基礎(chǔ)研究中對(duì)人肝細(xì)胞的巨大需求，以至于大量的基礎(chǔ)研究不得不用動(dòng)物的肝細(xì)胞來代替人的肝細(xì)胞。也有很多學(xué)者應(yīng)用肝葉切除的小塊肝組織，通過其殘存的肝臟小血管進(jìn)行二步法灌流分離肝細(xì)胞，但此方法對(duì)用于分離肝細(xì)胞的肝組織塊要求較高，必須具備有3～4支可供灌流的血管，但實(shí)際在手術(shù)中獲取的人肝組織塊大多極

5、不規(guī)則，很難找到血管，因而無法實(shí)施二步法灌流。而且即使找到血管，通過殘存的不規(guī)則血管進(jìn)行灌流，灌流非常不充分，進(jìn)而影響分離效果。因此，建立實(shí)用的從人肝臟分離肝細(xì)胞的細(xì)胞分離技術(shù)成為很多研究的必需。 本研究在經(jīng)典二步灌流法的基礎(chǔ)上，建立針對(duì)手術(shù)切除不規(guī)則小塊肝組織的多點(diǎn)穿刺兩步灌流分離成人肝細(xì)胞的新方法，使基礎(chǔ)研究中急需的人肝細(xì)胞的獲取更為簡(jiǎn)便、容易，從而為應(yīng)用人肝細(xì)胞進(jìn)行生物人工肝、細(xì)胞移植等研究提供技術(shù)保障。 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)

6、一步對(duì)多點(diǎn)穿刺灌流法分離獲得的原代人肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外短期培養(yǎng)，并間隔連續(xù)檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清白蛋白、尿素氮、細(xì)胞內(nèi)酶的水平，還檢測(cè)了培養(yǎng)細(xì)胞的代謝功能。從而，一方面，對(duì)多點(diǎn)穿刺灌流法能否分離獲得具有功能活性的肝細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，另一方面，對(duì)成人原代肝細(xì)胞在體外的培養(yǎng)過程中，其功能活性狀況的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析。 方法： 1.人肝組織標(biāo)本來源于南方醫(yī)院肝膽外科肝癌、肝血管瘤患者手術(shù)切除病變的周圍正常組織，約0.5～5g。

7、 2.采用本課題組建立的多點(diǎn)穿刺灌流法分離成人肝細(xì)胞。 具體肝細(xì)胞分離步驟包括：①應(yīng)用針頭注射器多點(diǎn)穿刺灌注預(yù)熱的38℃灌流液，使肝組織塊由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅墓嗔饕鹤兦辶?，灌注時(shí)壓力、流速要恒定，不能有氣泡。此過程大約10-15分鐘。②繼以38℃預(yù)溫的Ⅳ型膠原酶溶液針頭多點(diǎn)穿刺灌注，直至組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀，Ⅳ型膠原酶溶液可循環(huán)使用。此過程大約需15-20分鐘。⑨用無菌眼科剪刀剪開肝組織，并去除殘存的包膜和

8、纖維結(jié)締組織，放入無菌瓶中，繼續(xù)在膠原酶液中37℃震蕩消化15分鐘。④用粗口吸管將消化物吹打?yàn)榧?xì)胞懸液，在冰浴條件下，100目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集肝細(xì)胞懸液，移至離心管中。⑤4℃下，50g離心5分鐘，去上清，底層沉淀加入紅細(xì)胞裂解液室溫靜置3分鐘后，繼續(xù)50g×5分鐘，離心1次。⑥收集底層沉淀，用含DnaseⅠ的肝細(xì)胞洗滌緩沖液重懸細(xì)胞，再用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾。⑦4℃下，50g離心5分鐘，去上清，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離

9、心，棄上清，沉淀細(xì)胞置冰浴中備用。 3.收集的肝細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算肝細(xì)胞的活率和得率。用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)肝細(xì)胞，計(jì)算肝細(xì)胞24小時(shí)貼壁率。 4.用倒置相差生物顯微鏡及全自動(dòng)顯微攝影裝置對(duì)新鮮分離以及原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。 5.繪制多點(diǎn)穿刺灌注法分離獲得的原代成人肝細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 6.留取多點(diǎn)穿刺灌注法分離的原代人肝細(xì)胞培養(yǎng)1天、3天、5天、7天、9天后的上清液，

10、用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中尿素（BUN）、堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甲胎蛋白（AFP）的濃度。 7.ELISA法檢測(cè)多點(diǎn)穿刺灌注法分離的原代成人肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中白蛋白的含量。 8.RT-PCR檢測(cè)原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的AlbmRNA和細(xì)胞色素P4502E1mRNA的表達(dá)。 9.安定轉(zhuǎn)化試驗(yàn)檢測(cè)原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞代謝功能。 結(jié)果： 1.采用本課題組建立

11、的多點(diǎn)穿刺灌流法分離成人小塊不規(guī)則手術(shù)切除肝組織的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞的活率是87%±7%，分離得到的肝細(xì)胞總數(shù)為（2.2±0.7）×107/克肝組織，肝細(xì)胞貼壁率為75%左右，且鏡下觀察細(xì)胞碎片和其它非實(shí)質(zhì)細(xì)胞污染相對(duì)較少。此外，本方法還對(duì)原代肝臟腫瘤細(xì)胞的分離培養(yǎng)具有良好效果，分離成功率幾乎達(dá)100%。 2.全自動(dòng)生化分析儀間隔連續(xù)檢測(cè)原代成人肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中生化指標(biāo)顯示ALT和AST的水平都隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，而ALP無明

12、顯變化趨勢(shì)，AFP始終沒有檢測(cè)到，BUN的含量在短期體外培養(yǎng)中相對(duì)保持在一個(gè)高水平上。 3.ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)的成人肝細(xì)胞體外白蛋白分泌量在第三天達(dá)到最高峰，以后逐漸下降。原代人肝細(xì)胞培養(yǎng)第1天至第7天后細(xì)胞上清液中白蛋白的濃度分別是48.2±4.5 ng/ml、55.2±6.9 ng/ml、63.3±6.4 ng/ml、37.0±10.6 ng/ml、22.5±4.9 ng/ml、14.9±5.3、10.0±2.9ng/ml

13、。 4.RT-PCR可以檢測(cè)到多點(diǎn)穿刺灌流法獲得的成人原代肝細(xì)胞中Alb mRNA和細(xì)胞色素P4502E1 mRNA的表達(dá)，分別在374bp和338bp處出現(xiàn)明亮條帶。 5.人肝細(xì)胞在體外培養(yǎng)的7天內(nèi)均可有效發(fā)揮其對(duì)安定的代謝轉(zhuǎn)化作用，其中以體外培養(yǎng)的第3天左右轉(zhuǎn)化能力最強(qiáng)，之后有逐漸下降的趨勢(shì)。 結(jié)論： 1.創(chuàng)建了多點(diǎn)穿刺灌流法分離人肝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室操作程序，降低了對(duì)肝組織標(biāo)本的要求，使成人原代肝細(xì)胞的獲