殼聚糖衍生物對(duì)角膜細(xì)胞生長(zhǎng)影響的研究.pdf

1、角膜移植是目前治療角膜盲的有效方法,但是面臨著角膜供體嚴(yán)重缺乏、術(shù)后發(fā)生免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步,組織工程角膜為角膜缺損修復(fù)開辟了嶄新的治療前景。組織工程研究的核心是建立由細(xì)胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體,關(guān)鍵是生物支架材料的選擇和細(xì)胞的體外培養(yǎng)。迄今為止,被用作組織工程角膜支架的材料有膠原、羊膜、脫細(xì)胞角膜基質(zhì)、纖維蛋白、殼聚糖等,但材料各有缺點(diǎn),制約了其發(fā)展應(yīng)用。
　　 殼聚糖是一種天然聚陽(yáng)離子生物

2、多糖,具有可降解性和無(wú)毒副作用等性能,在組織工程角膜中已有較多的研究和應(yīng)用。但其生物相容性不能滿足眼內(nèi)植入的需要,限制了其深入研究。改性化的殼聚糖作為角膜組織工程支架材料的研究,其生物相容性方面會(huì)大大優(yōu)于殼聚糖,但隨著材料在體內(nèi)的逐步降解,產(chǎn)生的小分子量殼聚糖衍生物對(duì)角膜細(xì)胞的影響也將是評(píng)價(jià)材料安全性和功能性的一個(gè)重要研究?jī)?nèi)容。
　　 本課題以殼聚糖為基本材料,通過(guò)化學(xué)修飾改性和酶法降解制得多種殼聚糖衍生物,依次開展了理化性質(zhì)測(cè)

3、定、細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)及材料的角膜細(xì)胞相容性評(píng)價(jià),為角膜支架材料的生物安全性提供理論依據(jù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)取得以下幾個(gè)方面的成果和進(jìn)展:
　　 1.以殼聚糖為原料,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室化學(xué)制備工藝,向殼聚糖分子中引入小分子功能基團(tuán),改變殼聚糖的原有分子結(jié)構(gòu),制得四種在組織工程角膜中研究較多的水溶性殼聚糖衍生物(羧甲基殼聚糖、羧甲基甲殼質(zhì)、羥乙基殼聚糖和羥丙基殼聚糖),后經(jīng)殼聚糖酶降解形成寡糖(羧甲基殼寡糖、羧甲基甲殼寡糖和殼寡糖),并制得

4、了單糖(N-乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖鹽酸鹽),對(duì)材料進(jìn)行必要理化性質(zhì)的測(cè)定。采用顯微觀測(cè)和MTT相結(jié)合的方法測(cè)定了多種糖材料的細(xì)胞毒性,證明材料均無(wú)細(xì)胞毒性,且羧甲基甲殼質(zhì)、羥乙基殼聚糖、羧甲基甲殼寡糖和殼寡糖能促進(jìn)L929細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖,為材料的后續(xù)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)提供了理論支持。
　　 2.采用常規(guī)組織貼壁法體外培養(yǎng)兔角膜上皮細(xì)胞,獲得大量活性較高的細(xì)胞,為材料的細(xì)胞評(píng)價(jià)提供大量的細(xì)胞來(lái)源。采用顯微觀測(cè)和MTT相結(jié)合的方法測(cè)定了糖

5、材料對(duì)角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響,結(jié)果表明四種高分子多糖(羥乙基殼聚糖、羥丙基殼聚糖、羧甲基殼聚糖、羧甲基甲殼質(zhì))對(duì)角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)毒性,且羥乙基殼聚糖和羧甲基甲殼質(zhì)對(duì)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)有良好的促進(jìn)作用,提示四種水溶性殼聚糖衍生物可安全用作角膜上皮支架材料。其降解生成的低分子量氨基糖對(duì)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)也無(wú)毒性,且羧甲基甲殼寡糖和殼寡糖能明顯地促進(jìn)上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,提示二者可用作角膜上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基添加物。
　　 3.體外培養(yǎng)

6、獲得大量較高活性的角膜基質(zhì)細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞評(píng)價(jià)試驗(yàn),結(jié)果顯示9種殼聚糖衍生物材料對(duì)角膜基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)毒性,提示材料具有良好的細(xì)胞相容性。低分子量氨基糖N-乙酰氨基葡萄糖、殼寡糖、羧甲基甲殼寡糖和多糖硫酸軟骨素、羧甲基甲殼質(zhì)均能促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,提示N-乙酰氨基葡萄糖、殼寡糖、羧甲基甲殼寡糖可用于角膜基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)。硫酸軟骨素和羧甲基甲殼質(zhì)用作角膜支架材料起支撐作用的同時(shí)還能促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,有利于角膜的缺損修復(fù)和重建。實(shí)驗(yàn)制備