鱷膽素對(duì)膽管癌Mz-ChA-1細(xì)胞抗癌機(jī)理的大鼠慢性毒理的研究.pdf

1、目前,中醫(yī)藥中動(dòng)物藥對(duì)惡性腫瘤的作用受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注,由于其療效顯著、治療后不易復(fù)發(fā)、毒副作用小等特點(diǎn),在臨床上得到廣泛的應(yīng)用。其中動(dòng)物膽汁的抗腫瘤作用在國內(nèi)外都受到了極大的關(guān)注。
　　 本論文以體外培養(yǎng)的人膽管癌Mz-ChA-1細(xì)胞為對(duì)象,通過一系列的分離純化手段從暹羅鱷膽汁中提取到獲得具有抑制膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的活性物質(zhì)鱷膽素,并進(jìn)一步探討其抑制膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)理。應(yīng)用普通光學(xué)及熒光顯微鏡觀察鱷膽素對(duì)Mz-ChA-1

2、細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;PI單染檢測(cè)細(xì)胞周期變化;AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測(cè)經(jīng)鱷膽素處理后細(xì)胞的凋亡情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞內(nèi)ROS的積累情況和膜電位的變化;Westernblot測(cè)定相關(guān)基因p53、bax、Bcl-2、Rb和細(xì)胞色素C的表達(dá);用劃痕法、Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)研究了鱷膽素對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲和黏附能力的影響。結(jié)果表明,鱷膽素能明顯抑制Mz-ChA-1細(xì)胞的增殖,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯,細(xì)胞的形態(tài)

3、出現(xiàn)明顯的凋亡特征,AnnexinV-FITC/PI雙染顯示鱷魚膽汁能夠誘導(dǎo)Mz-ChA-1細(xì)胞凋亡。Western bioting的結(jié)果提示,鱷魚膽汁誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS的升高,線粒體膜通透性增加,細(xì)胞色素C釋放,通過激活了caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)了一系列的細(xì)胞凋亡的過程,與此同時(shí),Bax/Bcl-2比例的升高可以促使△Ψm下降,進(jìn)一步促使Cyt C從線粒體膜間隙中釋放,加速細(xì)胞凋亡。
　　 Mz-ChA-1細(xì)胞凋亡前后的蛋白雙

4、向電泳和質(zhì)譜分析共鑒定了13種表達(dá)差異核基質(zhì)蛋白,其中PHB表達(dá)下調(diào)。Western blotting實(shí)驗(yàn)證明,Mz-ChA-1細(xì)胞凋亡過程中PHB在蛋白和mRNA水平上均表達(dá)下調(diào)。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示PHB在Mz-ChA-1細(xì)胞中分別與AIF、p53、Rb和c-Fos等基因產(chǎn)物具有或強(qiáng)或弱的共定位關(guān)系,凋亡處理后其共定位區(qū)域發(fā)生了相應(yīng)變化。GST pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)Mz-ChA-1細(xì)胞中,PHB分別與p53和Rb有直

5、接相互作用關(guān)系。上述結(jié)果顯示,鱷膽素抗膽管癌作用的可能的分子機(jī)制是,細(xì)胞凋亡主要通過線粒體途徑,同時(shí)PHB通過與p53和Rb的相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生。對(duì)鱷膽素作用機(jī)理的研究,為膽管癌的藥物治療提供了新的線索,為鱷膽素在臨床上應(yīng)用于膽管癌的治療提供了基礎(chǔ)理論支持,也為鱷膽素抗膽管癌作用新靶點(diǎn)的闡明提供了新的思路和線索。
　　 采用灌胃的方式,對(duì)鱷膽素進(jìn)行了大鼠慢性毒理實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果顯示表明鱷膽素不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物組織器官損傷,對(duì)