基于MFH與熱控基因表達技術(shù)的磁性pHsp-HSV-TK-As-,2-O-,3-復(fù)合納米粒的制備及對肝癌細(xì)胞的治療研究.pdf

1、目的： ①研究Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒及As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒的制備及表征；②PEI對磁性As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒的表面修飾，特性檢測及作為基因載體可行性的研究；③PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒的生物相容性評價；④以PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒作為HSV-TK基因的載體對培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2

2、治療作用的研究。 方法： ①采用改良的化學(xué)共沉淀法制備Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒子，過量浸漬法制備As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4，聚乙烯亞胺（PEI）對其進行表面修飾。②采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM），掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM），X射線衍射分析（x-ray diffraction，XRD）

3、，傅立葉紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR），能譜儀（energy dispersive spectrometer， EDS）對修飾前后的磁性復(fù)合納米粒進行分析表征，原子熒光光度儀分析修飾前后復(fù)合物中的As含量及體外釋藥率，并在高頻交變磁場（AMF）下檢測Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁流體的升溫情況。③采用Bradford法測定PEI在納米粒子上的吸附量，瓊脂糖凝膠電泳檢

4、測PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4結(jié)合DNA的情況。利用pEGFP-C1觀察PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)染的效率及應(yīng)用β-gal報告基因系統(tǒng)檢測hsp70啟動子經(jīng)不同溫度熱誘導(dǎo)后基因在不同時間的表達情況。④采用MTT實驗、溶血試驗、微核試驗、小鼠LD50檢測等方法評價修飾后磁性納米粒子的生物相容性。⑤以修飾的復(fù)合材料作為pHsp70-HSV-TK質(zhì)粒的載體，轉(zhuǎn)染入肝癌細(xì)胞HepG2中

5、，并置于交變磁場中感應(yīng)升溫，誘導(dǎo)HSV-TK基因的表達。⑥MTT（methyl thiazolyl tetrazolium）法，流式細(xì)胞儀評價熱敏基因pHsp70-HSV-TK聯(lián)合熱化療對肝癌細(xì)胞生長的影響。 結(jié)果： ①制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒表征：TEM檢測顯示磁性納米粒為圓形、電子密度高、大小較一致；EDS證實制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米粒含有Mn，Zn，F(xiàn)e與O四種元素，且Mn

6、，Zn，F(xiàn)e元素的摩爾比符合0．5：0．5：2； XRD顯示制備的Mn0．5Zn0．5Fe2O4納米粒子各衍射峰所對應(yīng)的面間距（d值）與粉末衍射標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)合會（JCPDS）編制的代表物質(zhì)為尖晶石型磁性的PDF（Powder Diffraction File）卡片d值吻合一致，由峰值寬度計算其粒徑在6nm-22nm之間。②制備的As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒表征：SEM檢測顯示為圓形，密度、大小較均勻，直徑平均約20nm

7、； EDS證實制備的納米材料含有As、Mn、Zn、Fe及O四種元素。③體外升溫試驗：在輸出電流30A，輸出頻率230kHz的AMF作用下不同濃度的Mn0．5Zn0．5Fe2O4磁性納米?；鞈乙耗苌郎氐?9℃～50℃，且加熱40min后溫度能恒定在某一水平不發(fā)生改變。④修飾后的PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4表征：TEM顯示修飾后的納米粒子具有良好的分散性，F(xiàn)TIR及EDS分析驗證了PEI在磁性納米粒子表面的吸附，修飾前

8、后復(fù)合物中As的含量分別為4．46％和3．1％且可緩慢持續(xù)釋放，升溫試驗證實修飾后的As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4仍具有良好的升溫恒溫能力。⑤Bradford法測定PEI在納米粒子上的最大吸附量可達9．81mg/g；瓊脂糖凝膠電泳檢測到PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4與DNA結(jié)合情況良好：PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4可將外源基因轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞系并高效表達，且隨溫度的升高基因表達量

9、增加，在43．5℃達高峰，隨時間的變化基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的情況并在24h時達高峰。⑥L-929細(xì)胞MTT實驗、溶血試驗、微核實驗證實PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒無溶血作用、毒性低及無致畸致突變作用、符合生物材料的安全性要求；小鼠LD50檢測發(fā)現(xiàn)PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒的LD50為3．449g/kg，95％的可信區(qū)間為2．87-4．51g/kg，具有較廣的安全值范

10、圍。⑦RT-PCR方法檢測到了HSV-TK基因在HepG2細(xì)胞中的表達。⑨MTT實驗顯示PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4-HSV-TK（即磁性pHsp-HSV-TK/As2O3復(fù)合納米粒）能顯著抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，F(xiàn)CM檢測顯示其能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡及周期阻滯，且其效果較單純As2O3液及單純磁流體熱療組明顯。 結(jié)論： ①應(yīng)用化學(xué)共沉淀法及浸漬法已成功制備了Mn0．5Zn0．5Fe2O

11、4磁性納米粒和As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒且PEI成功地包覆于As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4的表面。②修飾前后的復(fù)合納米粒具有良好的磁響應(yīng)性及吸收磁能而升溫的能力，且可以作為基因的載體。③制備的PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4復(fù)合納米粒具有良好的生物相容性、可以進一步用于腫瘤的聯(lián)合治療。④細(xì)胞實驗顯示：PEI-As2O3/Mn0．5Zn0．5Fe2O4-HSV-TK復(fù)合納米粒的三重治