sEng、TGFβ1與妊娠期高血壓疾病發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、妊娠期高血壓疾病(Hypertensive disorder complicating pregnancy，HDCP)是妊娠期特有疾病，病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，已有研究表明，轉(zhuǎn)化生成因子TGFβ1及其受體與妊娠期高血壓疾病發(fā)生的中心環(huán)節(jié)-血管內(nèi)皮損傷及胎盤血管重鑄過程密切相關(guān)，本研究將通過觀察TGFβ1及其可溶性受體成份-sEng對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及滋養(yǎng)細(xì)胞的影響，探討其在妊娠期高血壓疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用。
　　第一

2、部分 sEng及TGFβ1與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的相關(guān)性研究目的：觀察可溶性Endoglin(soluble endoglin，sEng)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)對(duì)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelialcell，HUVEC)增殖、凋亡的影響，及其對(duì)HUVEC產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide，NO)量，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synt

3、hase，eNOS)1177位點(diǎn)絲氨酸磷酸化程度的影響，探討sEng及TGFβ1參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)HUVEC，將3代以內(nèi)的HUVEC接種于96孔培養(yǎng)板，分4組：對(duì)照組(單純RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組；根據(jù)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)結(jié)果，將sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組按加藥濃度分別分為1、10、100μg/L三個(gè)亞組，收集6

4、h、12h，24h時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞及培養(yǎng)液。ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1含量；MTT比色法檢測(cè)對(duì)照組、不同濃度sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)培養(yǎng)6h、12h、24h后HUVEC的細(xì)胞的存活率，流式細(xì)胞技術(shù)觀察各組凋亡率和細(xì)胞周期分布；硝酸酶還原法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量，Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)量及其1177位點(diǎn)絲氨酸磷酸化情況，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)各組細(xì)胞eNOS mRNA的相

5、對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：(1)細(xì)胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1的含量：24h、48h、72hHUVEC培養(yǎng)液中未測(cè)得sEng；24h、48h、72h細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1含量分別為(3.12±0.78)、(3.33±0.91)、(3.08±0.87)ng/L，三個(gè)時(shí)間段TGFβ1含量無(wú)明顯變化(F=2.10，p>0.05)。(2)細(xì)胞存活率：SEng組HUVEC存活率在各個(gè)濃度點(diǎn)及時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組和其它各組，且與時(shí)間和加藥濃度均呈

6、負(fù)相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時(shí)HUVEC表現(xiàn)為增殖，存活率高于對(duì)照組，加10、100μg/L時(shí)，HUVEC存活率與時(shí)間和加藥濃度均呈負(fù)相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組HUVEC存活率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，無(wú)時(shí)間及濃度依賴性。(3)細(xì)胞凋亡率和周期分布：sEng組，HUVEC凋亡率明顯增加，與加藥濃度及作用時(shí)間均呈正相關(guān)，sEng組G1期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，亦與濃度及時(shí)間呈正相關(guān)；TGFβ1各組HUVEC凋亡率與對(duì)照組各點(diǎn)比

7、較均無(wú)明顯差異，1μg/L組G1期細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組并與作用時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，10、100μg/L組G1期細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組且與作用濃度及時(shí)間呈正相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組HUVEC凋亡率、G1期細(xì)胞比例、存活率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，且無(wú)濃度及時(shí)間依賴性。(4)細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量變化：對(duì)照組培養(yǎng)液內(nèi)NO含量24 h內(nèi)無(wú)明顯變化(F=2.30，p>0.05)，sEng組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量低于對(duì)照組和其它各組并與作用時(shí)間和

8、加藥濃度均呈負(fù)相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量顯著高于對(duì)照組及其它各組，與作用時(shí)間呈正相關(guān)，加10、100μg/L時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量與時(shí)間和加藥濃度均呈負(fù)相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，亦無(wú)時(shí)間及濃度依賴性。(5)eNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平變化：sEng組，HUVEC eNOS蛋白及mRNA表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及濃度點(diǎn)均低于對(duì)照組及其它各組，且與作用時(shí)間及加藥濃

9、度呈明顯的負(fù)相關(guān)；TGFIβ1組，加1μg/L時(shí)eNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組及其它各組，且與時(shí)間呈正相關(guān)，加10、100gg/L時(shí)，eNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平在各個(gè)濃度點(diǎn)及時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組但高于sEng組，且與作用時(shí)間及濃度呈負(fù)相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及濃度點(diǎn)細(xì)胞eNOS蛋白及mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。(6)eNOS蛋白活化情況：sEng組，eNOS-Ser(p)1177

10、/eNOS在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及濃度點(diǎn)均低于對(duì)照組及其它各組，并與作用時(shí)間及加藥濃度呈負(fù)相關(guān)；TGFβ1組，加1μg/L時(shí)eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于對(duì)照組及其它各組并與時(shí)間呈正相關(guān)，加10、100μg/L時(shí)，eNOS-Ser(p)1177/eNOS在各個(gè)濃度點(diǎn)及時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組但高于sEng組，且與時(shí)間及濃度呈負(fù)相關(guān)；(sEng+TGFβ1)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)及濃度點(diǎn)細(xì)胞eNOS-Ser(p)1177/eNOS與對(duì)照

11、組比較無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：1、加入外源性sEng可與內(nèi)源性產(chǎn)生的TGFβ1結(jié)合阻斷TGFβ1的信號(hào)傳導(dǎo)，通過促進(jìn)凋亡，并使細(xì)胞受阻于G1期，延緩其從G1期向S期過渡的方式，抑制HUVEC的增殖，同時(shí)通過下調(diào)eNOS1177位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化水平，抑制eNOS的活性，使HUVEC分泌NO功能下降，進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞的舒縮功能。2、加入外源性的TGFβ1，對(duì)HUVEC的影響取決于作用濃度，高濃度TGFβ1主要通過使內(nèi)皮細(xì)胞受阻于G

12、1期，延緩其從G1期向S期過渡的方式，抑制HUVEC的增殖，同時(shí)通過下調(diào)eNOS1177位點(diǎn)絲氨酸的磷酸化水平，抑制eNOS的活性，使HUVEC分泌NO的能力下降，影響內(nèi)皮細(xì)胞的舒縮功能，低濃度的TGFβ1對(duì)HUVEC的作用與之相反。3、(sEng+TGFβ1)組HUVEC的增殖、eNOS活性、NO的產(chǎn)生與對(duì)照組比較無(wú)顯著差異，說明兩因子等量加入細(xì)胞培養(yǎng)液，sEng作為TGFβ1的受體，二者幾乎達(dá)到1:1結(jié)合，結(jié)合后二者均不能發(fā)揮前述作

13、用，推斷受體與配體成比例結(jié)合有助于內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮正常的作用，任一因子過量使比例失調(diào)，則對(duì)HUVEC產(chǎn)生不同程度的影響，進(jìn)而參與內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂。
　　第二部分 sEng與TGFβ1對(duì)人早孕絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)的影響目的：探討可溶性Endoglin與TGFβ1對(duì)人早孕絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞增殖能力和浸潤(rùn)功能的影響。
　　方法：采用胰蛋白酶-DNase消化法培養(yǎng)人早孕期(孕6～8周)絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞，將3代以內(nèi)的滋養(yǎng)細(xì)胞接種于96孔

14、培養(yǎng)板，分4組：對(duì)照組(單純DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng))、sEng組、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)組；ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中sEng及TGFβ1含量；MTT法觀察滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖情況并確定后續(xù)試驗(yàn)中sEng、TGFβ1及(sEng+TGFβ1)的加藥濃度及作用時(shí)間；MTT法觀察各組細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞技術(shù)觀察各組細(xì)胞的細(xì)胞周期變化，Transwell技術(shù)檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)功能；Western印跡法檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2、

15、MMP-9蛋白的表達(dá)；RT-PCR法檢測(cè)各組滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2、MMP-9mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論：sEng和TGFβ1可能通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的G1期細(xì)胞比例，影響其增殖能力，但并不導(dǎo)致細(xì)胞的死亡；通過調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)影響其浸潤(rùn)能力；在體外細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下，sEng和TGFβ1可達(dá)到1:1的結(jié)合，并失去各自對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的影響，據(jù)此推測(cè)，早孕期絨毛局部?jī)煞N因子比例失調(diào)，可能不同程度的影響滋養(yǎng)細(xì)胞向子宮肌層的正常浸