表沒食子兒茶素沒食子酸酯對全身性炎癥反應早期多形核白細胞臟器浸潤影響的研究.pdf

1、背景及目的:兒茶素單體表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是綠茶多酚類化合物的一種,具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、抗突變等生物學活性。以往大量實驗證實了EGCG等一系列兒茶素單體在腫瘤化學預防方面的功效,認為其參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的細胞信號通路中氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子的活性。其中核因子κB(NF-κB)和激活蛋白1(AP-1)為各種炎癥和腫瘤的發(fā)生侵襲過程共同涉及的關鍵轉(zhuǎn)錄因子。故而兒茶

2、素在腫瘤化學預防上的大量研究同時揭示了該類化合物在抗炎治療方面的巨大潛力。兒茶素類在動脈硬化、類風濕性關節(jié)炎等慢性炎癥性疾病中已經(jīng)被證明了具有積極的功效,EGCG更被證明為對炎癥細胞因子合成影響最顯著的兒茶素單體。但是相對于慢性炎癥,EGCG對急性炎癥過程的干預研究還不多。全身性炎癥反應綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS)是多器官功能不全綜合征(Multiple Organ

3、Dysfunction Syndrome,MODS)的重要病理生理發(fā)展通路。外周血多形核中性白細胞(polymorphonuclear neutrophilsw,PMNs)是引起組織損傷,甚至MODS的關鍵細胞。PMNs激活、聚集于靶組織和釋放大量破壞性酶類是導致組織損傷和MODS發(fā)生的主要途徑,在此過程中免疫趨化因子和細胞間粘附分子發(fā)揮了重大作用。局部組織合成的趨化因子,以及PMNs/內(nèi)皮細胞間的穩(wěn)定粘附過程,對于PMNs的貼壁、游出

4、、定向移動和大量靶器官“扣押”具有不可替代的重要作用。本課題結(jié)合革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導的小鼠急性肺損傷模型和TNF-α誘導的內(nèi)皮細胞炎癥模型進行一系列體內(nèi)體外研究,旨在探討EGCG作為一種高效價的天然抗氧化劑,在全身性炎癥反應早期對組織巨噬細胞合成趨化因子的影響,以及對PMNs/血管內(nèi)皮細胞間穩(wěn)定粘附的影響;并對以髓質(zhì)過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力代表的肺

5、組織PMNs浸潤程度作出評估,從而多方面地論證EGCG對SIRS早期PMNs遠隔臟器浸潤的影響。實驗方法:1.實驗動物和細胞的準備6周齡ICR小鼠,清潔級,EGCG分別以10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg的劑量行腹壁多點皮下注射預處理,以尾靜脈注射LPS10mg/kg方法造成內(nèi)毒素血癥,復制全身性炎癥反應動物模型。根據(jù)研究的需要分別在給予LPS6小時和18小時后處死小鼠,留取肺組織標本。傳代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human um

6、bilical vein endothelial cells,HUVEC)用含10％胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁生長至80%板底面積的HUVCE分別換用含EGCG終濃度為10μmol/l、20μmol/l、50μmol/l的新鮮培養(yǎng)基行1小時預處理,然后加入TNF-α使終濃度為10ng/ml,復制出內(nèi)皮細胞炎癥模型。根據(jù)研究的需要分別在給予TNF-α4小時和8小時后消化收集細胞用于指標檢測

7、。2.RT-PCR法分析小鼠巨噬細胞炎癥蛋白2(murine macrophage inflammatoryprotein2,MIP-2)和ICAM-1的基因表達水平在LPS攻擊6小時后處死各組小鼠,無菌留取肺組織;消化收集經(jīng)EGCG預處理和TNF-α誘導4小時后的HUVEC。TRIZOL法提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后PCR擴增,分別以小鼠β-Actin和人GAPDH為內(nèi)參照行半定量分析。3.免疫組化染色及形態(tài)學觀察在LPS攻擊18小時后處死

8、各組小鼠,留取肺組織固定,石蠟包埋,切片,以抗小鼠MIP-2多克隆抗體為一抗,辣根過氧化酶標記相應二抗結(jié)合,DAB顯色,蘇木素復染鏡檢,拍照。4.Western Blot法分析MIP-2和ICAM-1的蛋白表達水平在LPS攻擊18小時后處死各組小鼠,留取肺組織勻漿裂解;消化收集經(jīng)EGCG預處理和TNF-α誘導8小時后的HUVEC。提取總蛋白,行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,孵育以相應一抗、二抗,ECL發(fā)光液,曝光成像,以β-Actin為內(nèi)

9、參照對目的條帶的積分吸光度進行分析。5.肺組織MPO活力測定在LPS攻擊18小時后處死各組小鼠,留取肺組織,準確稱量并勻漿,利用MPO令供氫體鄰聯(lián)回香胺供氫后生成黃色化合物在460nm處有最大吸收峰的化學特性,用分光光度法檢測。按MPO檢測試劑盒說明操作和換算。6.噻唑蘭(MTT)試驗鑒定HUVEC細胞活力貼壁長滿75%的96孔板底面積的HUVEC,經(jīng)不同濃度EGCG預處理和TNF-α誘導8小時后更換含MTT終濃度5mg/ml的新鮮培養(yǎng)

10、基繼續(xù)孵育4小時,吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO),繼續(xù)孵育半小時,酶標儀490nm波長處測OD值。7.HUVEC跟PMNs的粘附實驗取健康成年人外周血10ml,用中性粒細胞分離液(聚蔗糖—泛影葡胺分層液)以密度梯度離心法得到較純的PMNs。臺盼藍拒染法檢測活力,血清培養(yǎng)基重懸PMNs。貼壁生長在24孔板底的HUVEC經(jīng)EGCG預處理和TNF-α誘導8小時后加入等量PMNs,再共孵育1小時,結(jié)束后輕洗去未粘附的PMNs,收集洗脫液,對

11、孵育前和洗脫液中的PMNs進行細胞計數(shù),計算出粘附率。8.數(shù)據(jù)統(tǒng)計數(shù)字結(jié)果以均數(shù)±標準差表示,多組間結(jié)果比較采用單因素方差分析,P<0.05認為有統(tǒng)計學顯著性差異。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理使用SPSS10.0版完成。結(jié)果:1.EGCG使內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷小鼠肺部MIP-2的mRNA表達和蛋白合成呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.免疫組化和組織病理發(fā)現(xiàn)EGCG使內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷小鼠肺部MIP-2蛋白表達減少,并且使

12、肺間質(zhì)腫脹和白細胞浸潤情況減輕。3.EGCG使內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷小鼠肺部MPO活力呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。4.50μmol/l的EGCG濃度導致了TNF-α誘導的HUVEC和正常生長的HUVEC的凋亡增加(P<0.05),而10μmol/l、20μmol/l兩個濃度的EGCG不引起HUVEC的活力改變(P>0.05)。5.EGCG使TNF-α誘導的HUVEC的ICAM-1的mRNA表達和蛋白合成呈劑量依

13、賴性下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。6.EGCG使TNF-α誘導的HUVEC跟PMNs間的粘附率呈劑量依賴性下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論:本研究在動物實驗中發(fā)現(xiàn)EGCG抑制內(nèi)毒素誘導全身炎癥反應的小鼠肺部趨化因子的合成以及減少肺組織PMNs的浸潤程度,在細胞實驗中發(fā)現(xiàn)EGCG抑制TNF-α誘導的HUVEC膜表面重要粘附分子的合成以及抑制HUVEC和PMNs間的粘附,并發(fā)現(xiàn)這些效應呈現(xiàn)一定的濃度和劑量依賴性。故