半胱氨酰白三烯及CvsLT1受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子β1對星形膠質(zhì)細胞的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、研究背景：
　　 腦缺血后的炎癥反應(yīng)在其病理生理發(fā)生過程中起了重要作用。腦缺血損傷發(fā)生后，促進外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的促炎癥因子表達并分泌至細胞外，誘導(dǎo)腦內(nèi)炎癥變化，其結(jié)果之一是激活星形膠質(zhì)細胞并逐漸形成膠質(zhì)疤痕，研究炎癥因子激活星形膠質(zhì)細胞，有助于了解膠質(zhì)疤痕形成機制和干預(yù)途徑。腦缺血后腦內(nèi)炎癥因子包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactorβ1，TGF-β1)以及半胱氨酰白三烯類(cysteinylle

2、ukotrienes，CysLTs)。TGF-β1被廣泛認為是一種與損傷相關(guān)的細胞因子，CysLTs是一類重要的炎癥介質(zhì)，兩者在腦缺血、腦外傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病發(fā)病中均起重要作用。
　　 TGF-β1在正常腦組織中表達水平不高。腦缺血后，TGF-β1mRNA在腦組織中早期(缺血后6h)表達增加，缺血后2～4天達高峰，持續(xù)14～26天；缺血早期在全腦彌散表達，7～14天后主要表達于星形膠質(zhì)細胞，與腦缺血后膠質(zhì)疤痕的形成有關(guān)；

3、體外實驗表明，TGF-β1能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞增生肥大；促進星形膠質(zhì)細胞遷移。
　　 CysLTs由5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LOX)催化花生四烯酸而形成，其作用通過半胱氨酰白三烯受體(cysteinylleukotrienereceptor，CysLT受體)起作用，該類受體主要包括CysLT1和CysLT2受體兩種亞型。CysLT1受體在正常腦組織中表達水平不高。腦缺血后，缺血中心區(qū)CysLT1受體mRN

4、A在缺血再灌注3、6、12h和7、14天表達上調(diào)；缺血周邊區(qū)，再灌注后3天內(nèi)CysLT1受體mRNA水平?jīng)]有變化，7、14天明顯增高，主要表達于增生的星形膠質(zhì)細胞。藥理學(xué)研究表明，CysLT1受體抑制劑pranlukast抑制小鼠局灶性腦缺血后誘導(dǎo)的膠質(zhì)疤痕形成。
　　 在大鼠星形膠質(zhì)細胞，輕度缺氧缺糖(oxygen-glucosedeprivation，OGD)誘導(dǎo)CysLT1受體表達，并介導(dǎo)體外星形膠質(zhì)細胞的增殖、激活；而C

5、ysLT2受體則介導(dǎo)中度OGD誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞損傷。CysLT1受體介導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞激活的機制尚待闡明。由于星形膠質(zhì)細胞激活受多種因素調(diào)節(jié)，CysLT1受體的效應(yīng)可能與其他因素存在相互作用。
　　 在外周組織中，TGF-β1能上調(diào)支氣管平滑肌細胞中CysLT1受體的表達，增強LTD4的促增殖作用；TGF-β1能上調(diào)胎兒肺成纖維細胞中CysLT1受體的表達；TGF-β1能增加樹突狀細胞中5-LOX和5-LOX激活蛋白(FLAP)

6、的表達，增加白三烯的合成。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TGF-β1與CysLTs及其受體之間是否有相互調(diào)節(jié)的作用？如何調(diào)節(jié)？尚待闡明。尤其對星形膠質(zhì)細胞激活，TGF-β1與CysLT1受體的相互作用，是本文擬闡明的問題。
　　 研究目的：
　　 本文擬觀察半胱氨酰白三烯及CysLT1受體與TGF-β1在調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞中的相互作用，進行以下幾個方面的研究：
　　 1.首先，闡明CysLT1受體是否與TGF-β1相互作用。

7、觀察TGF-β1以及CysLT受體相關(guān)藥物對細胞活性的影響，包括5-LOX抑制劑、CysLT1和CysLT2受體激動劑和拮抗劑。
　　 2.其次，進一步闡明TGF-β1與CysLT1受體之間的可能相互作用。重點觀察TGF-β1與CysLT受體激動劑、拮抗劑及siRNA對星形膠質(zhì)細胞激活的作用，包括對增殖和遷移作用的影響。
　　 3.然后，為了闡明TGF-β1與CysLT1受體之間的相互作用特點，從兩個方面進行解析，一方面

8、分析TGF-β1對CysLT1受體及其內(nèi)源性激動劑CysLTs合成酶5-LOX的調(diào)節(jié)作用；另一方面，分析CysLT1受體激動劑對TGF-β1的調(diào)節(jié)作用。
　　 4.最后，為了闡明TGF-β1與CysLT1受體之間的相互作用的意義，在以往輕度OGD(1h)增強CysLT1受體表達及效應(yīng)結(jié)果的基礎(chǔ)上，觀察輕度OGD是否增加TGF-β1釋放。
　　 研究方法：
　　 選用原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞作為細胞模型，

9、細胞劃痕方法檢測細胞遷移；MTT還原試驗法檢測細胞活性；流式細胞術(shù)檢測細胞的增殖；細胞免疫化學(xué)法檢測細胞中5-LOX的核膜移位；ELISA法檢測CysLTs釋放；RT-PCR、Westernblot和細胞免疫熒光法檢測細胞中5-LOX、CysLT1受體和CysLT2受體表達。以CysLT受體非選擇性激動劑LTD4、CysLT2受體激動劑NMLTC4、TGF-β1信號抑制劑repsox，5-LOX抑制劑齊留通(zileuton)，CysL

10、T1受體選擇性拮抗劑孟魯司特(montelukast)和CysLT2受體選擇性拮抗劑BaycysLT2進行藥理學(xué)干預(yù)處理，CysLT1受體siRNA進行基因干擾處理。
　　 在大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細胞中，以O(shè)GD1h和4h誘導(dǎo)缺血性損傷。以MTT法、LDH法檢測OGD/恢復(fù)(OGD/R)后星形膠質(zhì)細胞的活性及損傷程度，并以ELISA法檢測TGF-β1釋放。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.TGF-β1與CysLT受體

11、對星形膠質(zhì)細胞活性的影響
　　 原代培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細胞中，MTT還原試驗法表明，TGF-β1和CysLT受體非選擇性激動劑LTD4可增強細胞活性，并且，兩者有相互增強；而CysLT2受體激動劑NMLTC4則無作用。TGF-β1的作用可被5-LOX抑制劑zileuton、CysLT1受體拮抗劑montelukast減弱，而CysLT2受體拮抗劑BaycysLT2則無作用。這一結(jié)果初步表明TGF-β1與CysLT1受體的相互作用

12、。
　　 2.TGF-β1與CysLT1受體對星形膠質(zhì)細胞增殖和遷移功能的影響
　　 為了進一步闡明TGF-β1與CysLT1受體的相互作用，觀察了TGF-β1與CysLT受體相關(guān)藥物對星形膠質(zhì)細胞增殖及遷移的作用。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，不同濃度的TGF-β1與LTD4在24h內(nèi)對星形膠質(zhì)細胞的增殖均沒有顯著影響。細胞劃痕法檢測顯示，TGF-β1能夠促進星形膠質(zhì)細胞的遷移活性(劃痕愈合)，并呈一定的時間劑量依賴性；低濃

13、度LTD4(0.1～10nM)也能促進星形膠質(zhì)細胞的遷移，兩者合用具有協(xié)同作用。NMLTC4(0.01～100nM)對星形膠質(zhì)細胞遷移沒有影響。TGF-β1信號抑制劑repsox能夠完全逆轉(zhuǎn)TGF-β1的作用；5-LOX抑制劑齊留通(zileuton)，CysLT1受體選擇性拮抗劑孟魯司特(montelukast)及CysLT1受體siRNA處理后均能減弱TGF-β1的作用；但CysLT2受體選擇性拮抗劑BaycysLT2對TGF-β1

14、的作用沒有顯著影響。這一結(jié)果表明，CysLT1受體及其內(nèi)源性配體合成酶5-LOX介導(dǎo)TGF-β1促進星形膠質(zhì)細胞激活(遷移增強)的作用。
　　 3.TGF-β1與5-LOX/CysLT1受體的相互調(diào)節(jié)作用
　　 為了闡明TGF-β1與CysLT1受體相互作用的特點，觀察了兩者間的相互調(diào)節(jié)。RT-PCR、Westernblot和細胞免疫熒光法檢測細胞顯示，TGF-β1上調(diào)5-LOX和CysLT1受體表達，對CysLT2受體

15、表達沒有顯著影響。細胞免疫化學(xué)法檢測顯示，TGF-β1作用于星形膠質(zhì)細胞6h后發(fā)生5-LOX明顯的移位，從細胞漿轉(zhuǎn)移至細胞核膜上，24h后恢復(fù)。ELISA法檢測顯示，TGF-β1作用于星形膠質(zhì)細胞1.5h后細胞培養(yǎng)基中的CysLTs含量顯著增加，12h時達到高峰，維持到24h。另一方面，RT-PCR和ELISA法檢測顯示，不同濃度的LTD4或NMLTC4(1-100nM)作用于星形膠質(zhì)細胞，對細胞中TGF-β1的表達和釋放均沒有顯著影響

16、。這一結(jié)果表明，TGF-β1與CysLT1受體相互作用的形式，是TGF-β1增加CysLT1受體內(nèi)源性配體的產(chǎn)生，并增加CysLT1受體表達，從而增強CysLT1受體的效應(yīng)；但是，CysLT1受體對TGF-β1沒有明顯影響。
　　 4.輕度OGD誘導(dǎo)TGF-β1釋放
　　 以往報道，輕度OGD增強CysLT1受體表達并激活星形膠質(zhì)細胞，在此驗證了這一現(xiàn)象與TGF-β1之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，OGD1h恢復(fù)不同時間(48h和

17、72h)后，細胞的活性依次增強，LDH釋放沒有顯著變化；OGD1h后恢復(fù)12h，TGF-β1釋放顯著增高。但是，中度OGD(4h)損傷誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞損傷，而TGF-β1釋放沒有改變。這表明輕度缺血性損傷后星形膠質(zhì)細胞激活與TGF-β1/CysLT1受體調(diào)節(jié)密切相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.星形膠質(zhì)細胞活性的藥理學(xué)實驗中，初步表明TGF-β1與CysLT1受體及5-LOX存在相互作用。
　　 2.對星形膠質(zhì)細胞

18、激活(增殖和遷移)的作用表明，CysLT1受體及其內(nèi)源性配體合成酶5-LOX介導(dǎo)TGF-β1促進星形膠質(zhì)細胞遷移增強的作用，但它們對細胞增殖無明顯影響。
　　 3.相互作用特點的研究結(jié)果表明，TGF-β1與CysLT1受體相互作用的形式是TGF-β1增加CysLT1受體內(nèi)源性配體的產(chǎn)生，并增加CysLT1受體表達，從而增強CysLT1受體的效應(yīng)；但是，CysLT1受體對TGF-β1沒有明顯影響。
　　 4.輕度OGD(1