半胱氨酰白三烯受體介導小鼠興奮性毒性腦損傷及腦冷凍傷.pdf

1、腦缺血、腦外傷等腦損傷性疾病,是發(fā)病率、致殘率和致死率均高的中樞神經病變,故對腦缺血、腦外傷等損傷/抗損傷機制的研究,探索其防治措施,有重要的意義.在過去的15～20年,越來越多的證據(jù)表明,神經興奮性毒性對神經元缺失所起的作用是最主要的發(fā)病機制之一,其中,N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體在介導急性谷氨酸興奮性毒性中起到關鍵性作用,NMDA受體拮抗劑的應用能降低實驗動物缺血性腦損傷中的神經元

2、死亡. 白三烯類(1eukotrienes,LTs)是花生四烯酸經5一脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOx)代謝產生的一族脂類炎性介質.LTs包括白三烯B4(LTB4)以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes,CysL,Ts,包括LTC4、LTD4、LTE4).CysLTs通過激活半胱氨酰白三烯受體(包括CysLT<,1>和CysLT<,2>受體),參與多種炎癥病理過程,介導平滑肌痙攣、微血管

3、滲漏等反應. 這兩種受體(CysLT<,1>和CysLT<,2>受體)己相繼被克隆.它們均為經典的G蛋白偶聯(lián)7次跨膜受體,與Gq蛋白偶聯(lián).很多CysLTs受體拮抗劑也相繼被開發(fā),如孟魯司特(montelukast)、普魯司特(pranlukast)等.早期,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體研究主要集中在外周組織,如呼吸系統(tǒng)等外周疾病.近幾年來的研究表明,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體也在中樞神經系統(tǒng)表達,可

4、能參與腦缺血、腦外傷和腦退行性疾病等中樞疾病.腦缺血后,腦內5-LOX表達增加、活性增高,其代謝產物CysLTs顯著增加;CysLT<,1>和CysLT<,2>受體也被誘導表達. 我們實驗室也發(fā)現(xiàn),CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特和孟魯司特可保護實驗動物的腦缺血性損傷.而且,在腦外傷和腦腫瘤病人的神經元樣和膠質樣細胞,CystLT<,1>和CysLT<,2>這兩種受體均可誘導表達.目前,已有研究證明腦缺血時,CysLTs濃度

5、一時性增高,并且該作用與NMDA受體激活有關.然而,還沒有直接證據(jù)顯示CysLT<,1>和CysLT<,2>受體在興奮性毒性中的作用. 尚未闡明,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體在神經元中是否有表達?是否直接參與了神經元的興奮性毒性損傷? 本研究擬建立小鼠皮層直接注射NMDA誘導腦興奮性毒性損傷模型,并闡述上述問題.同時,在另一種實驗動物腦損傷模型一小鼠腦冷凍傷模型上,觀察CysLT<,1>受體的表達特征,以及CysL

6、T<,1>受體拮抗劑普魯司特對腦冷凍傷的治療時間窗. 第一部分 小鼠NMDA誘導腦損傷后腦內半胱氨酰白三烯受體1表達增加 介導神經元損傷興奮性毒性在腦損傷中起關鍵性作用;半胱氨酰白三烯(CysLTs)及其受體(CysLT<,1>受體)也參與腦損傷病理過程.但兩者間的關系尚無直接證據(jù)證明.為研究CysLT<,1>受體在興奮性毒性腦損傷中的作用,首先建立了皮層直接注射NMDA (50～150 nmol,0.5μ1)誘導興奮性

7、毒性腦損傷模型.觀察NMDA注射24 h后,CysLT<,1>受體在腦內的表達情況;同時觀察了CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特(0.01和0.1 mg/kg)、NMDA受體拮抗劑氯胺酮(30 mg/kg)及自由基清除劑依達拉奉(9 mg/kg)的作用.我們發(fā)現(xiàn),NMDA誘導腦損傷后,CysLT<,1>受體的mRNA和蛋白表達上調;并且,免疫雙標染色結果顯示,CysLT<,1>受體誘導表達于損傷區(qū)的神經元.普魯司特、氯胺酮和依達拉奉對

8、NMDA誘導腦損傷具有保護作用.普魯司特(0.1 mg/kg)、氯胺酮能抑制CysLT<,1>受體表達上調.這些結果表明,CysLT<,1>受體可能介導NMDA誘導的神經元興奮性毒性損傷. 第二部分 小鼠NMDA誘導腦損傷后腦內半胱氨酰白三烯受體2的表達特征 CysLT<,2>受體是最近得到克隆和鑒定的CysLT受體之一,它相對較高地表達于人腦組織,在多個腦區(qū)都有分布.在腦外傷病人腦樣本中,CysLT<,2>受體誘導表達

9、于神經元樣細胞和膠質樣細胞.為進一步研究CvsLT<,2>受體在興奮性毒性腦損傷中的變化,我們用RT-PCR和免疫組織化學方法,研究了小鼠NMDA誘導腦損傷后,CysLT<,2>受體在腦內的表達特征.RT-PCR結果顯示,在損傷區(qū)CysLT<,2>受體mRNA在NMDA注射后24 h表達上調;而非損傷的對側腦區(qū)CysLT<,2>受體mRNA水平沒有變化.免疫雙標染色結果顯示,NMDA損傷后24h,CysLT<,2>受體主要表達于損傷區(qū)的

10、神經元,而不表達于星形膠質細胞.這些結果表明,CvsLT<,2>受體在興奮性毒性腦損傷后可能介導急性期神經元損傷. 第三部分小鼠腦冷凍傷后半胱氨酰白三烯受體1的表達及拮抗劑普魯司特時間依賴性保護作用 最近,我們報道在腦外傷病人樣本中,CysLT<,1>受體誘導表達于神經元樣和膠質樣細胞.為進一步研究CysLT<,1>受體在腦外傷中的作用,我們研究了小鼠腦冷凍傷后3 h～48 h,CysLT<,1>受體在腦內表達的時間特征

11、;同時觀察損傷后給予CvsLT<,1>受體拮抗劑普魯司特,對小鼠腦冷凍傷的治療作用.RT-PCR結果顯示,在損傷后6 h,12 h和24 h,損傷側皮層CvsLT<,1>受體mRNA表達上調,而非損傷的對側皮層CysLT<,1>受體mRNA水平在48 h內沒有變化.免疫雙標染色結果顯示,腦冷凍傷后24 h,CysLT1受體主要表達于損傷周邊區(qū)神經元,而不表達于星形膠質細胞.CysLT1受體拮抗劑普魯司特,對小鼠腦冷凍傷具有時間依賴的神經

12、保護作用,其治療時間窗為損傷后30 min.這些結果提示,CysLT1受體介導腦冷凍傷后急性期神經元損傷;普魯司特對腦外傷可能具有治療作用. 結論 1. 小鼠皮層注射.NMDA誘導興奮性毒性腦損傷后CysLT<,1>和CysLT<,2>受體表達上調.腦損傷后24 h,CysLT<,1>和CysLT<,2>受體主要表達于損傷區(qū)的神經元,而不表達于星形膠質細胞.表明CysLT<,1>和CysLT<,2>受體可能與NMDA誘導

13、的神經元興奮性毒性損傷有關. 2.CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特,能減輕NMDA誘導的神經元損傷,并抑制損傷后的CysLT<,1>受體表達上調,證實CysLT<,1>受體介導NMDA誘導的神經元興奮性毒性損傷. 3.小鼠腦冷凍傷后CysLT<,1>受體表達上調,表達高峰是6～24 h;主要表達于損傷周邊區(qū)的神經元.CysLT<,1>受體拮抗劑普魯司特對小鼠腦冷凍傷具有時間依賴的神經保護作用,其治療時間窗為損傷后30