組織工程支架材料及其降解產(chǎn)物血管化功能的體外研究及表征方法的建立.pdf

1、本論文課題來源為國家自然科學(xué)基金項目“可降解生物材料與內(nèi)皮細胞界面反應(yīng)對內(nèi)皮細胞功能蛋白表達的影響及機理研究”(No.30370411)。 理想的組織工程材料應(yīng)具有可控的生物降解性。要解決組織生長和材料降解的匹配問題，必須了解材料在使用中的生物學(xué)過程，并闡明材料降解與細胞生長和組織構(gòu)建的相互作用機制。這是一個材料學(xué)與生命科學(xué)交叉的課題，也是生物材料研究中的難點。血管化問題是組織工程取得成功的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，研究生物材料對組織血管化過程

2、的影響和機理，設(shè)計和開發(fā)促血管化的支架材料是組織工程對生物材料的挑戰(zhàn)。已有研究表明，材料的三維結(jié)構(gòu)和表面性質(zhì)可顯著影響血管形成，但材料降解產(chǎn)物會不會影響以及如何影響血管形成目前尚不清楚。 本論文針對以上問題，借鑒醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究方法，建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能的表征體系。在此基礎(chǔ)上，研究了組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能，結(jié)合對材料降解產(chǎn)物的表征和降解規(guī)律的研究，探討了降解時間及降解產(chǎn)物組分與血管化功能之間的關(guān)系。同時還

3、研究了改性對材料/細胞界面上內(nèi)皮細胞行為的影響。 1．建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能表征體系。 依據(jù)血管形成過程及其分子調(diào)節(jié)機制，選擇內(nèi)皮細胞形成血管的三大步驟(包括增殖、遷移和血管樣結(jié)構(gòu)TLS的形成)為細胞水平指標，調(diào)節(jié)血管形成的VEGF、MMP-2的基因表達和F-actin重組作為分子水平指標，建立了組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能細胞水平和分子水平的的表征體系。新建了細胞遷移定量檢測方法CMQM;新建了TLS的

4、定量檢測方法TLSQM;選擇MTT比色法檢測細胞增殖，實時熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測VEGF和MMP-2 mRNA的表達；BODIPYFL標記的鬼筆環(huán)肽標記F-actin，在熒光顯微鏡下觀察其組裝情況。 2．研究了三類組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能。 分別以殼聚糖、聚乳酸和摻鍶聚磷酸鈣為例，以生理鹽水為降解介質(zhì)和對照，采用上述表征體系對天然高分子、合成高分子及生物陶瓷三大類組織工程材料降解產(chǎn)物的血管化功能進行了研究。

5、結(jié)果表明，三類材料在生理鹽水中均可降解，降解產(chǎn)物隨時間累積，改變細胞生長的微環(huán)境，并對內(nèi)皮細胞形成血管的重要步驟和調(diào)節(jié)血管形成的功能蛋白表達以及細胞骨架重構(gòu)都有顯著影響：可抑制也可促進血管化，取決于材料的種類和降解時間。且細胞水平和分子水平結(jié)果基本一致(摻鍶聚磷酸鈣的研究還表明體內(nèi)動物實驗和體外表征結(jié)果一致)。但降解時間的影響以及降解產(chǎn)物中單體所起的作用都各有不同。分述如下： (1)天然高分子殼聚糖(CS)降解產(chǎn)物的血管化功能降

6、解時間的影響：在120天的降解時間內(nèi)，細胞反應(yīng)受到抑制不是在降解后期，而是在降解中期(20天～60天)。提示，天然高分子材料CS降解時間的延長和降解產(chǎn)物的累積不是影響內(nèi)皮細胞行為的決定因素。不同時期產(chǎn)生的降解產(chǎn)物可能具有不同的分子結(jié)構(gòu)，從而具有不同的生物活性。 氨基葡萄糖(GS)單體的作用：在120天的降解時間內(nèi)，CS降解液中GS濃度介于0.05～0.37mmol/L范圍內(nèi)。該濃度下，單純的GS對內(nèi)皮細胞增殖和遷移無顯著影響，對

7、TLS的作用效果也不同于降解液。提示，CS的降解產(chǎn)物中，影響內(nèi)皮細胞行為的主要因素不是GS單體及其量的累積，而可能是GS齊聚物或與GS單體的共同作用。 (2)合成高分子聚乳酸(PLA)降解產(chǎn)物的血管化功能降解時間的影響：降解初期(前7天)，對細胞增殖、遷移和TLS的形成均無不良影響，或有一定促進。但隨著降解時間的延長，細胞行為受到抑制：降解30天后顯著抑制細胞遷移和TLS形成，降解90天顯著抑制細胞增殖。提示，對合成材料PLA，

8、適量的降解產(chǎn)物有促血管化功能，而過量累積則會嚴重敖壞細胞生態(tài)環(huán)境，抑制其生長。乳酸(LA)單體的作用：120天的降解時間內(nèi)，PLA降解液中LA單體濃度介于(16.13～431.32]mmol/L 之間，堿水解后LA總濃度介于(63.91～799.91)mmol/L之間。該濃度下單純的LA已顯著抑制細胞行為，但PLA降解液中LA濃度達到190mmol/L時才對細胞增殖有顯著抑制。提示，乳酸齊聚物的存在可降低高濃度單分子乳酸對細胞的毒性作用

9、。 (3)生物陶瓷摻鍶聚磷酸鈣(SCPP)的血管化功能降解時間的影響：與生理鹽水和聚磷酸鈣(CPP)比較，SCPP90天的降解產(chǎn)物對內(nèi)皮細胞行為幾乎都有促進作用。 鍶元素的作用：單純的鍶元素對細胞遷移無明顯影響，但濃度在10nmol/L～1mmol/L范圍內(nèi)可不同程度地提高細胞增殖和形成TLS能力。SCPP90天降解產(chǎn)物中鍶元素濃度介于3.92μmol/L～20.65gmol/L之間，對血管化有明顯的促進作用。

10、3.組織工程材料改性對材料/細胞界面上內(nèi)皮細胞行為的影響 對本論文重點研究的三種生物材料(CS、PLA以及CPP)分別進行改性，研究改性前后材料的細胞毒性和材料/細胞界面反應(yīng)對內(nèi)皮細胞行為的影響，結(jié)合改性前后材料性質(zhì)變化探討了改性對細胞行為影響的機理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改性對三種材料的細胞毒性均無不良影響，卻顯著改變了細胞在材料表面的粘附、鋪展以及形成TLS等行為。分述如下： (1)海藻酸鈉(ALG)改性對內(nèi)皮細胞在CS表面行為

11、的影響： 改性對CS表面性質(zhì)的影響：AFM和水接觸角實驗結(jié)果表明，海藻酸鈉改性能顯著降低CS的表面粗糙度，增加表面親水性； 改性對細胞行為的影響：細胞在CS表面形成TLS結(jié)構(gòu)，與膠原凝膠表面的TLS類似；但改性后的表面具有抗內(nèi)皮細胞粘附的性能。材料表面親水性的增加和粗糙度的下降可能導(dǎo)致細胞粘附下降的原因。 (2)磷脂膽堿改性對PLA表面內(nèi)皮細胞行為的影響： 改性對PLA表面性質(zhì)的影響：水接觸角和攝水率結(jié)果

12、表明，磷脂膽堿改性能提高聚乳酸的親水性，且隨著磷脂含量的增加，親水性增強；XPS分析表明，改性后的材料在水環(huán)境發(fā)生表面重構(gòu)，磷脂膽堿基團從材料的本體向表面發(fā)生翻轉(zhuǎn)。改性對細胞行為的影響：與改性前相比，PC/LLA比例為1/46和1/30的材料表面，細胞的粘附和鋪展相對滯后，但繼續(xù)培養(yǎng)，細胞能在材料上完全粘附和鋪展，并且增殖。細胞初期粘附鋪展滯后可能是材料親水性增強造成的。而具有生物活性的磷脂官能團向材料表面翻轉(zhuǎn)使材料表面發(fā)生重構(gòu)，可能是

13、使細胞最終實現(xiàn)粘附并增殖的原因。 (3)摻鍶改性對CPP表面內(nèi)皮細胞行為的影響： 改性對CPP表面性質(zhì)的影響：摻鍶能顯著影響CPP的微觀結(jié)構(gòu)。摻鍶后材料晶粒尺寸增大，晶粒間連接緊密，形成更平滑的表面；摻鍶能顯著減少CPP經(jīng)培養(yǎng)液浸泡后表面形成的凝膠狀物質(zhì)。 改性對細胞行為的影響：摻鍶改性能顯著促進ECV304細胞在CPP表面的粘附和鋪展，其原因可能是摻鍶減少CPP凝膠并降低其表面粗糙度。 本論文首次建立了

14、組織工程材料降解產(chǎn)物血管化功能表征體系，為組織工程材料功能性的表征和評價提供新的思路和方法參考。對三類生物材料的表征發(fā)現(xiàn)，材料降解產(chǎn)物可改變細胞的微生態(tài)環(huán)境，進而顯著改變內(nèi)皮細胞形成血管的關(guān)鍵步驟以及調(diào)節(jié)血管形成的生長因子和蛋白酶的基因表達。該結(jié)果提示要解決組織工程中的血管化問題，必須重視材料降解產(chǎn)物對血管化的影響。對組織工程材料不僅要評價其安全性，還應(yīng)深入研究其血管化功能。本論文的研究也為解決組織工程血管化問題探索了從非生長因子角度促