新型藻酸鹽創(chuàng)面敷料及組織工程支架的開發(fā)研究.pdf

1、創(chuàng)面是正常皮膚在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。常伴有皮膚完整性的破壞以及一定量正常組織的丟失，同時，皮膚的正常功能受損。也稱為傷口或者創(chuàng)傷。重建或恢復(fù)皮膚功能是創(chuàng)面治療的最終目標，在達到這個目標前，一個性能優(yōu)良的創(chuàng)面覆蓋物可暫時起到皮膚屏障功能的部分作用，提供一個有利于創(chuàng)面愈合的環(huán)境，等待創(chuàng)面上皮化或過渡到重建永久性的皮膚屏障。隨著科技進步和醫(yī)學(xué)發(fā)展，人們研

2、制出大量不同類型的創(chuàng)面覆蓋物——敷料。隨著對創(chuàng)面愈合過程的病理生理的深入研究，人們對創(chuàng)面愈合過程的理解也越來越深刻，從而導(dǎo)致了創(chuàng)面敷料的不斷改進與發(fā)展。今天，新型的創(chuàng)面敷料相對于早期而言，已經(jīng)發(fā)生了革命性的變化。敷料的演進是從最早期的被動型敷料，發(fā)展到相互作用型敷料，繼之又演變到現(xiàn)今的生物活性型敷料。 然而，天然紗布、棉摯和合成纖維等被動型敷料(傳統(tǒng)敷料)僅具有覆蓋創(chuàng)面、吸收滲出物及為創(chuàng)面提供保護的作用，而且其通透性太高，容易使

3、創(chuàng)面脫水進而粘著創(chuàng)面，更換時造成再次性機械性損傷，外界環(huán)境微生物容易通過，交叉感染的機會高，用量多，更換頻繁，費時且患者痛苦等缺點限制了其臨床應(yīng)用。水凝膠及水膠體類相互作用型敷料通過敷料與創(chuàng)面之間存在著多種形式的相互作用，如吸收滲液以及有毒物質(zhì)、允許氣體交換，從而為愈合創(chuàng)造一個理想的環(huán)境；其阻隔性外層結(jié)構(gòu)，防止環(huán)境中微生物侵入，預(yù)防創(chuàng)面交叉感染等。但是其吸收滲液能力有限，導(dǎo)致創(chuàng)面周圍皮膚浸漬機會大，因此這類敷料只能應(yīng)用于滲液較少的創(chuàng)面。

4、自上世紀六十年代以來，在創(chuàng)面處理領(lǐng)域的研究探討取得的三次里程碑式的重大進展對創(chuàng)面敷料的應(yīng)用與發(fā)展提出了更高的要求，人們認識到敷料還應(yīng)該自身具有生物活性，才能更好的為創(chuàng)面愈合提供適宜的微環(huán)境，加快創(chuàng)面愈合速度。所以我們擬在合成新型藻酸鹽基質(zhì)材料的基礎(chǔ)上復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子制備新型藻酸鹽生物活性敷料，探討其抗感染作用和對創(chuàng)面的促進愈合作用，以其為創(chuàng)面處理提供更佳的新型敷料。 [目的]以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(ED

5、C)為催化劑，用乙二胺交聯(lián)海藻酸鈉，制備新型藻酸鹽基質(zhì)材料；然后將其作為基質(zhì)材料復(fù)合表皮生長因子及蜂蜜，研制出新型生物活性敷料，并對其進行表征；觀察其體內(nèi)體外的抗感染作用和對創(chuàng)面的促進愈合作用；同時探討其作為組織工程真皮支架材料的可行性。 [方法] 第一部分：發(fā)揮EDC的促進快速多肽縮合反應(yīng)的水溶性碳二亞胺型縮合劑作用，用乙二胺交聯(lián)海藻酸鈉制成1.75﹪、2﹪、2.5﹪3種不同濃度的基質(zhì)材料樣品及以Ca離子交聯(lián)濃度2﹪海

6、藻酸鈉的對照樣品(分別設(shè)為1＃、2＃、3＃、4＃)。然后采用相分離法(即冷凍干燥法)，第一步預(yù)凍，在零下80℃下將材料制成所需要的形狀；第二步進行冷凍干燥，在接近真空的條件下升華溢出溶劑分子；然后將四個樣品分別噴金鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察，拍照對比。通過體外模擬體液的方法測定其含水量，用排液法測定其孔隙率，完成對其物理性能的表征，對比四種材料的優(yōu)劣，確定選擇濃度為2﹪的基質(zhì)材料作為敷料基質(zhì)。根據(jù)材料最大吸液量以及全層皮膚缺損創(chuàng)面失

7、液量的估計，蜂蜜的最低有效抗菌濃度及表皮生長因子的有效作用濃度區(qū)間確定敷料配比。取海藻酸鈉0.2g、乙二胺240μl、EDC0.1936g，經(jīng)過化學(xué)合成后透析，冷凍干燥處理制成基質(zhì)材料。然后將蜂蜜、表皮生長因子與薄膜在密封盒內(nèi)進行物理吸附，制備敷料。設(shè)定速度為5cm/min，分別選取厚度為0.5cm的兩種敷料使用萬能電子拉力試驗機(同本島津AG-J型)測掘公式測量其拉力，計算敷料的拉力系數(shù)，比較敷料的抗拉強度。用紫外分光光度計法測定表皮

8、生長因子的含量，計算EGF的累計釋放量，探討敷料對EGF控釋作用。采用紙片法，實驗分三組，A組：實驗材料為復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子藻酸鹽生物活性敷料；B組：藻酸鹽敷料(法國優(yōu)格公司提供)；C組：鹽水紗布。觀察三種敷料分別對三種致病菌(金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853)的抑菌環(huán)直徑。按照國家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的“醫(yī)療器械生物學(xué)評價標準(GB/T166886)”推薦的方法，用L929細

9、胞檢測新型敷料的細胞毒性，對敷料的細胞相容性進行評價。最后取30只SPF級SD大鼠，每只大鼠背部制做兩個滴加金黃色葡萄球菌液(ATCC25923)O．1ml(4×10<'6>CFU/ml)面積約1×1cm<'2>的皮膚全層損傷創(chuàng)面，分實驗組和對照組，實驗組用復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子藻酸鹽生物活性敷料覆蓋，對照組采用藻酸鹽敷料(由法國優(yōu)格公司提供)覆蓋。觀察大鼠全身一般狀況及創(chuàng)面局部，按Nagelschmidt法計算各時相點創(chuàng)面愈合率；敷料

10、覆蓋24小時后，氣體栓塞法處死實驗用大鼠6只，每組取6個創(chuàng)面，無菌條件下取創(chuàng)面基底組織做細菌培養(yǎng)；取3、7、14天實驗用SD大鼠一只，制做創(chuàng)周皮膚全層標本，HE染色，光鏡觀察對比。用SPSS統(tǒng)計分析軟件對創(chuàng)面的愈合面積進行統(tǒng)計學(xué)分析，探討敷料對創(chuàng)面的抑菌和促進愈合作用。第二部分：通過體外模擬體液的方法測定材料的體外降解百分率，以此來測定材料的分子響應(yīng)時間；然后嘗試人類的成纖維細胞與新型藻酸鹽基質(zhì)材料體外共培養(yǎng)構(gòu)建組織工程真皮，置于掃描電

11、子顯微鏡下觀察，拍照。 [結(jié)果] 1 利用乙二胺作為交聯(lián)劑，EDC作為催化劑制備藻酸鹽基質(zhì)材料，并在其基礎(chǔ)上成功的制備了復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子新型生物活性敷料。以水合乙二胺共價交聯(lián)得到的藻酸鹽生物敷料更加透明和柔軟、具有優(yōu)良的組織相容性、吸水率更高。復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子新型生物活性敷料在模擬體液的條件下以一種較為平緩的方式來調(diào)控表皮生長因子的釋放，按照體液滲出的大致規(guī)律，能夠滿足創(chuàng)面愈合所需要的量。復(fù)合蜂蜜及表皮生長因

12、子新型生物敷料具有較好的細胞相容性。初步證實了復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子新型生物活性敷料對會黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853的體外抑菌作用。敷料覆蓋動物污染創(chuàng)面后，實驗組創(chuàng)面愈合良好，在多個時相點，創(chuàng)面面積小于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義。創(chuàng)面敷料覆蓋24小時后，實驗組較對照組創(chuàng)面基底細菌量顯著少于對照組，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 2 材料兩周的時間內(nèi)只損失了自重的12﹪，到八周以后

13、降解大約自重的一半，能夠與細胞的增殖速度相匹配。將支架材料用于組織工程真皮的構(gòu)建，結(jié)果表明材料內(nèi)部和表面均有細胞成長，并能夠分泌細胞外基質(zhì)。 [結(jié)論] 1 利用乙二胺作為交聯(lián)劑，EDC作為催化劑制備藻酸鹽基質(zhì)材料，并在其基礎(chǔ)上復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子成功的制備了新型生物活性敷料，復(fù)合蜂蜜及表皮生長因子藻酸鹽生物活性敷料生物相容性良好，力學(xué)性能佳，對污染創(chuàng)面有抗菌促進愈合作用。 2 新型藻酸鹽支架材料是一種可行的組織