白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變與氟康唑耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、背景：
　　 隨著廣譜抗生素和糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，介入治療和器官移植的普遍開展，艾滋病、腫瘤和糖尿病病人的增加，念珠菌感染呈逐年上升的趨勢。在臨床治療的過程中，由于抗真菌藥物的廣泛和長期應(yīng)用導(dǎo)致了耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，影響臨床治療效果，因此研究真菌耐藥的分子機制不僅有利于發(fā)現(xiàn)新的藥物治療靶點還能更好的指導(dǎo)臨床用藥。
　　 氟康唑是1978年發(fā)現(xiàn)的氟代三唑類藥物，具有抗菌譜廣、半衰期長(27-34h)、生物利用度高

2、、不良反應(yīng)發(fā)生率低、可通過血腦屏障等優(yōu)點，是目前治療念珠菌感染的首選藥物。但長期反復(fù)的應(yīng)用導(dǎo)致了氟康唑耐藥菌株的出現(xiàn)。
　　 白念珠菌是念珠菌感染的首要致病菌。從基因水平研究白念珠菌對氟康唑耐藥機制的報道主要集中于歐美國家，國內(nèi)研究相對較少。目前研究認(rèn)為，白念珠菌耐藥主要有以下三種機制：(1)藥物靶酶基因ERG11突變或過度表達(dá)；(2)外排泵基因(CDR1、CDR2、MDR1)的過度表達(dá)；(3)生物膜的形成。
　　 麥角

3、固醇是真菌細(xì)胞膜的特有脂質(zhì)。它維持著細(xì)胞膜的完整性和正常功能。細(xì)胞色素P450依賴的14α－去甲基化酶(Erg11 p)是麥角固醇合成途徑中的限速酶，其編碼基因為ERG11基因。氟康唑可以與14α-去甲基化酶結(jié)合從而影響該酶的活性，進(jìn)而阻止麥角固醇的合成。ERG11基因的點突變可導(dǎo)致編碼蛋白的改變從而影響Erg11 p的空間構(gòu)象，引起Erg11 p與藥物的親和力降低或底物/藥物進(jìn)出通道發(fā)生改變。迄今報道的ERG11基因錯義突變已逾160

4、種。
　　 在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)14株氟康唑耐藥的白念珠菌僅含有G487T和T916C突變，且并不伴隨其它突變。最近有文章報道在人工誘導(dǎo)的氟康唑耐藥株中也同樣發(fā)現(xiàn)這兩個突變。到目前為止，G487T和T916C兩突變僅在氟康唑耐藥菌株中出現(xiàn)，但其與氟康唑耐藥的關(guān)系并未得到實驗室證實。
　　 目的：
　　 運用表達(dá)質(zhì)粒過表達(dá)和基因敲除的方法，研究ERG11基因6487T和T916C突變與白念珠菌氟康唑耐藥的關(guān)系。<

5、br>　　 方法：
　　 1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測定和ERG11基因突變檢測
　　 應(yīng)用微量稀釋法對前期分離的氟康唑耐藥株GZ16和標(biāo)準(zhǔn)株SC5314(由Richard Calderone教授惠贈)進(jìn)行氟康唑MIC的測定。分別提取兩株菌的基因組DNA，參照白念珠菌ERG11標(biāo)準(zhǔn)序列(GeneBank X13296)設(shè)計引物，擴(kuò)增GZ16和SC5314的ERG11基因并測序。
　　 2.E

6、RG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 以GZ16的ERG11基因為模板，通過重疊PCR得到無突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段，膠回收純化后分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO。以GZ16、pFA-CaURA3、pFA-SAT1為模板，通過PCR得到ERG11基因下游片段、URA3選擇

7、標(biāo)記片段、SAT1選擇標(biāo)記片段，經(jīng)膠回收純化分別與T載體pGM-T連接得到質(zhì)粒pGM-DOWN、pGM-URA3、pGM-SAT1。
　　 用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別雙酶切質(zhì)粒pGM-916C、pGM-DOWN、pGM-URA3、和PCDNA3.1，得到具有粘性末端的4片段：含T916C突變的ERG11片段、URA3選擇標(biāo)記片段、ERG11基因下游片段和pCDNA3.1片段。4片段經(jīng)連接酶連接后得到以URA3為選擇標(biāo)記含突變片段的

8、質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3，該質(zhì)粒骨架為pcDNA3.1。重復(fù)以上步驟得到以URA3為選擇標(biāo)記的無突變的、含G487T突變、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-TWO-URA3，以及以SAT1為選擇標(biāo)記的無突變的、含G487T突變的、含T916C突變的、含G487T和T916C兩突變的突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-SAT1、

9、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1-TWO-SAT1。
　　 以pGM-N、pGM-487T、pGM-916C、pGM-TWO為模板，PCR擴(kuò)增，得到無突變、含G487T突變、含T916C突變、含G487T和T916C兩突變的ERG11基因片段，片段雙酶切后分別與釀酒酵母表達(dá)載體YEP351G連接得到釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G-487T、YEP35

10、1G-916C和YEP351G-TWO。
　　 3.含不同突變的YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測定
　　 采用醋酸鋰轉(zhuǎn)化的方法，分別用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G－916C、YEP351G－487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1，用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基篩選陽性克隆，并測定陽性克隆對氟康唑的MIC值。
　　 4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測定

11、>　　 限制性內(nèi)切酶HindⅢ和NheⅠ雙酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-916C-URA3得到相應(yīng)的長度為3.7kb的敲除片段，醋酸鋰轉(zhuǎn)化白念珠菌CAI4，尿嘧啶缺陷的培養(yǎng)基選擇陽性克隆，并測定陽性克隆對氟康唑的MIC值。
　　 結(jié)果：
　　 1.白念珠菌GZ16和SC5314 MIC值的測定和ERG11基因突變檢測
　　 白念株菌GZ16為我們以前實驗驗證的氟康唑耐藥菌株，經(jīng)5次傳代后其氟康唑MIC值仍為64μ

12、g/ml。標(biāo)準(zhǔn)株SC5314的氟康唑MIC值為2μ g/ml，為氟康唑敏感菌株。GZ16僅含有G487T和T916C突變。SC5314含有T462A、T495A、A504G、A530C、C558T、C805T、A1167G、A1587G突變，其中氨基酸錯義突變?yōu)镕105L(T462A)、D116E(T495A)、K128T(A530C)。
　　 2.ERG11基因突變片段質(zhì)粒的構(gòu)建和釀酒酵母突變表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 構(gòu)建

13、了以URA3為選擇標(biāo)記的ERG11基因突變片段質(zhì)粒pcDNA3.1-N-URA3、pcDNA3.1-487T-URA3、pcDNA3.1-916C-URA、pcDNA3.1-TWO-URA3，以及以SAT1為選擇標(biāo)記的 ERG11基因突變片段質(zhì)粒 pcDNA3.1-N-SAT1、pcDNA3.1-487T-SAT1、pcDNA3.1-916C-SAT1、pcDNA3.1－TWO－SAT1；并成功構(gòu)建了釀酒酵母突變表達(dá)載體YEP351G-

14、N、YEP351G－487T、YEP351G－916C和YEP351G-TWO。
　　 3.YEP351G表達(dá)載體在釀酒酵母中的表達(dá)與氟康唑藥敏測定
　　 用質(zhì)粒YEP351G-N、YEP351G－916C、YEP351G－487T、YEP351G-TWO轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVSc1后，用亮氨酸缺陷的培養(yǎng)基成功篩選出相應(yīng)的陽性克隆株INVSc1+N、INVSc1+487T INVSc1+916C、INVSc1+TWO，其對氟

15、康唑的MIC值分別為32μ g/ml、32μ g/ml、128μ g/ml、128μ g/ml，釀酒酵母INVSc1對氟康唑的MIC值為8μ g/ml。
　　 4.白念珠菌T916C突變菌株的構(gòu)建與氟康唑敏感性測定
　　 在T916C突變菌株的構(gòu)建中用尿苷缺陷的培養(yǎng)基成功得到5株陽性克隆株(T1-T5)，其中有3株存在T916C突變(T1、T3、T5)，而兩株雖然發(fā)生了同源重組但無T916C突變(T2、T4)。CIA-4

16、、T1、T2、T3、T4、T5對氟康唑的MIC值分別為2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml、2μ g/ml、4μ g/ml。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功構(gòu)建了含白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的突變片段質(zhì)粒和能表達(dá)白念珠菌ERG11基因G487T和T916C突變的釀酒酵母突變表達(dá)載體。
　　 2.首次證實了白念珠菌ERG11基因T916C突變與氟康唑耐藥有關(guān)。