低氧誘導(dǎo)的ER應(yīng)激及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在人肝細(xì)胞癌中作用的初步研究.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（Endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞最重要的細(xì)胞器之一，它是一種由封閉的膜系統(tǒng)以及相互溝通的膜腔而形成的一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，它參與了蛋白質(zhì)的合成與組裝，分泌與轉(zhuǎn)位等，可以說在細(xì)胞生命活動(dòng)中扮演著重要的角色。當(dāng) ER中未折疊或者錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集超過了 ER負(fù)荷時(shí)，就會(huì)引起其發(fā)生一系列的適應(yīng)性反應(yīng)，其中最重要的應(yīng)答反應(yīng)當(dāng)屬未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）。作為ER應(yīng)激

2、反應(yīng)最敏感最重要的感應(yīng)器蛋白-糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-regulated protein，GRP78），亦被稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（Binding immunoglobulin protein，BiP），首先會(huì)與ER膜上的三個(gè)跨膜傳感器蛋白IRE1（Inositol-requiring transmembrane kinase/endonuclease1）、PERK（PKR-like Endoplasmic Reticulu

3、m Kinase）以及ATF6（Activating Transcription Factor6）解離，當(dāng)這一解離過程完成后，使得原先被BiP封閉的信號(hào)通路激活。PERK活化后會(huì)磷酸化真核起始轉(zhuǎn)錄因子eIF2ɑ，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)整體mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯水平明顯降低，同時(shí)又會(huì)選擇性的增強(qiáng)某些mRNA的轉(zhuǎn)錄翻譯，其中就包括激活轉(zhuǎn)錄因子4（Activating Transcription Factor4，ATF4）及其下游靶基因CHOP（CCAAT/

4、enhancer binding protein homologous protein）；活化的IRE1同時(shí)具備激酶和核酸內(nèi)切酶的作用，IRE1自身磷酸化后剪切XBP1(X-box-binding protein1)的mRNA產(chǎn)生剪切型的sXBP1，使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨问?，活化的IRE1同時(shí)募集并激活應(yīng)激激酶JNK（Jun N-teminal Kinase）；此外與BiP解離的ATF6則迅速轉(zhuǎn)位到高爾基體，被其內(nèi)部的蛋白水解酶剪切成為有活性

5、的轉(zhuǎn)錄因子?？傊甎PR通路的激活的最終目的一方面增強(qiáng)了 ER折疊蛋白的能力并通過ER降解部分錯(cuò)誤折疊蛋白（ER-associated degradation，ERAD），一方面減少蛋白質(zhì)的合成減輕ER負(fù)荷，在細(xì)胞面對(duì)外界刺激如缺氧、低糖/高糖、鈣離子濃度改變、營(yíng)養(yǎng)缺乏等時(shí)促進(jìn)細(xì)胞生存；而當(dāng)應(yīng)激條件持續(xù)存在則會(huì)導(dǎo)致適應(yīng)性反應(yīng)失靈，細(xì)胞凋亡程序被啟動(dòng)。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transitio

6、n，EMT）是指上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞表型的生物學(xué)過程，主要特征表現(xiàn)為上皮細(xì)胞粘附分子蛋白如鈣黏附蛋白（E-cadherin）表達(dá)減少，細(xì)胞骨架蛋白轉(zhuǎn)化為波形蛋白（vimentin）,最終導(dǎo)致細(xì)胞與基底膜的連接作用減弱，細(xì)胞本身失去極性，從而獲得了較高的侵襲遷移能力，細(xì)胞的抗凋亡能力也相應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)產(chǎn)生額外的細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix，ECM)。
　　ER應(yīng)激作為細(xì)胞一種適應(yīng)性的反應(yīng)被認(rèn)為與許多疾病

7、的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有著密切的關(guān)系，如神經(jīng)退行性變、病毒所致的感染性疾病以及惡性腫瘤等；而也有越來越多的研究證據(jù)表明 EMT使得上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤獲得侵襲遷移能力在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮了重要的作用。惡性實(shí)體腫瘤中時(shí)常存在高代謝以及過度增殖的特點(diǎn)，癌巢中通常存在氧供不足，因此本論文的研究目的主要就是探究由低氧誘導(dǎo)的ER應(yīng)激以及EMT在人肝細(xì)胞癌中的作用，并通過實(shí)驗(yàn)得到了如下初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）構(gòu)建了ER應(yīng)激重要的感應(yīng)蛋白Bi

8、P質(zhì)粒并通過western blot以及細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證其在不同細(xì)胞株中的表達(dá)；
　?。?）通過組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌組織中ER及EMT均表達(dá)上調(diào)；
　?。?）低氧刺激誘導(dǎo)的不同肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中ER以及EMT相關(guān)基因上調(diào)，并通過半定量PCR以及western blot分別從mRNA水平及蛋白水平得到驗(yàn)證；
　?。?）在癌組織切片中通過免疫熒光雙標(biāo)意外發(fā)現(xiàn)BiP異位表達(dá)及與低氧誘導(dǎo)因子（HIF1ɑ）存在共定位的現(xiàn)象；<