針對(duì)BAK的siRNA抑制由膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞凋亡及其機(jī)制.pdf

1、目的:樹突狀細(xì)胞與膠質(zhì)瘤共培養(yǎng)，觀察膠質(zhì)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞凋亡；觀察針對(duì)BAK的siRNA對(duì)樹突狀細(xì)胞凋亡的影響，檢測(cè)相應(yīng)的凋亡基因，探討其可能凋亡通路，為膠質(zhì)瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。 方法:樹突狀細(xì)胞與膠質(zhì)瘤細(xì)胞通過孔徑0.4μm Trans—well共培養(yǎng)，設(shè)置空白DC2.4，為對(duì)照組，采用MTT法觀察其活性，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100％。采用脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染表達(dá)針對(duì)BAK的siRNA序列的質(zhì)粒(A：

2、229序、B：310序、C：579序、D：NC序)進(jìn)入樹突狀細(xì)胞，并利用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)株，通過western blot和PCR的方法鑒定出穩(wěn)定表達(dá)有效干擾序列的樹突狀細(xì)胞；穩(wěn)定表達(dá)有效干擾序列的樹突狀細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)(b組)，設(shè)置a組空白DC2.4、c組膠質(zhì)瘤細(xì)胞和DC2.4共培養(yǎng)兩個(gè)對(duì)照組，24h后觀察樹突狀細(xì)胞凋亡的改變。通過western blot測(cè)定相關(guān)基因BAK的表達(dá)，觀察caspase8，caspase3及胞漿

3、中的細(xì)胞色素C的變化，進(jìn)而推斷出凋亡的可能通路。 結(jié)果:膠質(zhì)瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)后，與空白樹突狀細(xì)胞組相比樹突狀細(xì)胞的活性降低了，吸光值與空白樹突狀細(xì)胞組相比為0.514±0.031；含有siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入樹突狀細(xì)胞后，各組BAK的表達(dá)均降低，以PGPU6/GFP/Neo—BAK-310組為明顯。western blot和RT-PCR檢測(cè)出310序列BAK的表達(dá)降低(western blot：A：0.83、B：0.14、C

4、：0.75、D：0.89、未轉(zhuǎn)染：0.92；RT-PCR：A：0.42、B：0.08、C：0.39、D：0.46、未轉(zhuǎn)染：0.49P<0.05)。穩(wěn)定表達(dá)有效干擾序列的樹突狀細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后，與c組相比樹突狀細(xì)胞的活性較高，樹突狀細(xì)胞的caspase8表達(dá)量無明顯差異(a：0.78 b：0.75 c：0.77，P>0.05)，caspase3及胞漿中的Cytc減少(caspase3：a：0.67 b：0.70 c：0.2；Cyt