化妝品安全性評價中皮膚毒性若干替代實驗方法的研究.pdf

1、本文擬在借鑒歐盟研究成果的基礎上，對化妝品安全性評價中若干皮膚毒性的替代實驗方法進行研究。目的是為國內開展相關方法學研究和制定我國化妝品安全性評價替代實驗方法的技術指南提供依據。 一、小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)方法的改進研究 目的：改進小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)，建立既可檢測化學物的致敏性也可同時檢測刺激性的LLNA替代方法。方法：選取一種陰性物質：4-氨苯甲酸；三種致敏陽性物：2，4-二硝基氯苯(DNCB)、己

2、基肉桂醛(HCA)和2-氨基酚(2-APC)；以及兩種刺激陽性物：氫氧化鉀(KOH)、十二烷基硫酸鈉(SDS)。按常規(guī)LLNA方法對雌性Balb/c小鼠進行染毒，測量小鼠耳緣厚度，于第6天仁慈處死小鼠稱量耳廓重量，獲取耳引流淋巴結進行稱重，制備單細胞懸液計數并用cck-8試劑盒檢測淋巴細胞增殖活性。結果：受試劑量氫氧化鉀、十二烷基硫酸鈉和2，4-二硝基氯苯在0.5％以上劑量，可引起耳緣厚度和耳廓重量增加，與對照組相比差異有顯著性(p＜0

3、.05)，可能判定為對皮膚有刺激性；2-氨基酚和己基肉桂醛均無刺激性。三種致敏物在致敏試驗中均呈陽性，但不同檢測指標敏感性有差異。己基肉桂醛，2，4-二硝基氯苯，2-氨基酚均可引起淋巴結重量增加，差異有顯著性(p＜0.05)；三者均可引起淋巴細胞計數增加，但己基肉桂醛僅在最高劑量組有統(tǒng)計學差異；己基肉桂醛和2，4-二硝基氯苯在中劑量以上組和高劑量十二烷基硫酸鈉均可致cck-8檢測的淋巴細胞增殖明顯增加，氫氧化鉀在致敏性指標中均為陰性。結

4、論：以耳緣厚度和耳廓重量作為刺激性觀察指標，以淋巴結重量和淋巴細胞增殖作為致敏性觀察指標的改良小鼠淋巴結試驗可有效地同時評價化學物的皮膚致敏性和刺激性，有發(fā)展成為一種替代方法的潛力。 二、皮膚刺激性EpidermTM模型實驗方法的建立 目的：通過構建重組人EpiDerm皮膚模型，建立檢測化妝品的皮膚腐蝕性/刺激性的替代實驗方法。方法：取人的包皮組織，分離表皮和真皮后分別進行原代培養(yǎng)，用鼠尾膠原構建皮膚模型，經氣液面培養(yǎng)后

5、，腐蝕性試驗作用3min和1h，刺激性試驗作用15min后續(xù)培養(yǎng)42h，檢測化學物致皮膚模型細胞活性的改變(MTT試驗)和IL-1α的釋放量(ELISA法)，評價化學物的腐蝕性/刺激性。結果：腐蝕性試驗中，MTT檢測作用于3種腐蝕性化學物(正辛酸、10％KOH、丙烯酸)后，細胞相對活性均＜50％(3min)和＜15％(1h)；而2種非腐蝕性化學物(四氯乙烯、丁香酚)使細胞相對活性變化不大。刺激性試驗中，MTT檢測4種刺激性化學物細胞相對

6、活性，其中3種化學物(三氯乙烷、5％KOH、10％SDS)致細胞活性明顯小于50％，2種非刺激性化學物(乙醇、丙二醇)和1％TritonX-100作用后細胞活性＞50％，在ELISA試驗中，僅TritonX-100致IL-1α釋放量大于60pg/ml，說明其同樣具有刺激性。結論：所建人重組皮膚模型實驗方法基本成功，可以做為檢測化學物皮膚腐蝕性/刺激性的體外替代方法。 三、THP-1細胞體外致敏性試驗方法的研究 目的：探討

7、建立以THP-1為受試細胞，以細胞表面標志物CD54和CD86的抗體表達改變?yōu)闄z測指標的體外致敏性試驗方法。方法：采用人單核細胞系白血病淋巴瘤細胞THP-1，經過細胞因子GM-CSF、IL-4誘導分化成未成熟樹突狀細胞后，分別對未誘導THP-1細胞和誘導后細胞給予受試物，用流式細胞儀檢測細胞表面標志物CD54和CD86的抗體表達改變，評價化學物對皮膚的致敏性。結果：致敏物DNCB、HCA、EN作用于THP-1細胞后，DNCB和EN能使C

8、D54和CD86的抗體熒光表達增強，與對照相比大于140％，但HCA致熒光增強不明顯。受試物作用經誘導后的未成熟樹突狀細胞，表面抗體的熒光表達量都未見明顯增高。結論：采用THP-1細胞檢測CD54和CD86的抗體表達的試驗方法，可檢測中高致敏性化學物，但不適合弱致敏性化學物的評價。 四、利用人皮膚組織模型研究納米TiO2的經皮吸收和致突變性 目的：探討納米TiO2能否穿透皮膚組織并產生基因突變作用。方法：構建人重組皮膚模

9、型后培養(yǎng)于Tanswell小室上方，下層培養(yǎng)L5178Y細胞，將納米TiO2作用于皮膚模型上，采用微孔板Tk基因突變的試驗方法檢測下層L5178Y細胞是否發(fā)生基因突變。結果：隨著受試納米TiO2濃度的增加，直接接觸和間接接觸細胞的相對懸浮生長率均呈下降趨勢，但間接接觸的細胞相對懸浮生長率普遍大于直接接觸者。隨著劑量的增加，平板效率和相對存活率也呈現下降趨勢，但各組間TFT突變率卻無明顯差別。結論：納米TiO2能穿透人皮膚組織模型，但皮膚