P19細(xì)胞移植和神經(jīng)生長因子局部注射防治大鼠神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷以后，骨骼肌由于喪失了支配神經(jīng)的營養(yǎng)性作用，加之神經(jīng)再生速度緩慢，在神經(jīng)再分布之前，骨骼肌往往已發(fā)生嚴(yán)重的萎縮，故而嚴(yán)重影響肢體運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。積極探討運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的治療措施無疑具有重要的意義。近年來的研究表明，來源于C3H/He雄性小鼠畸胎瘤的P19細(xì)胞具有多種分化潛能，其在特定誘導(dǎo)條件下可以分化為神經(jīng)組織。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，采用將特定誘導(dǎo)條件下向神經(jīng)方向分化的P19細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)損傷

2、遠(yuǎn)端局部移植、神經(jīng)生長因子局部注射以及兩者結(jié)合的方法，對(duì)防治神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的療效進(jìn)行比較與評(píng)價(jià)。 方法：（1）P19細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化：P19細(xì)胞用含有1×10<'-6>M維甲酸(retinoid acid，RA)的10％FBS/αMEM培養(yǎng)液成團(tuán)培養(yǎng)4天待用。部分成團(tuán)培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)0.5％胰蛋白酶-5.3mmol/L EDTA消化后在N2無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)12天，觀察細(xì)胞形態(tài)變化。（2）P19細(xì)胞移植和神經(jīng)生長因子局部注

3、射防治神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究：取96只SD大鼠隨機(jī)分為坐骨神經(jīng)切斷組(A組)以及坐骨神經(jīng)切斷后神經(jīng)外膜縫合組(B組)，各組再分四小組：P19細(xì)胞移植組(1×10<'6>個(gè)/ml，術(shù)中及術(shù)后每?jī)芍芤浦惨淮?、神經(jīng)生長因子注射組(5μg/ml，術(shù)中以及術(shù)后一個(gè)月每日注射)、P19細(xì)胞移植聯(lián)合神經(jīng)生長因子注射組和陰性對(duì)照組，分術(shù)后4周、8周兩個(gè)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、腓腸肌肌濕重恢復(fù)率、P19細(xì)胞的存活情況評(píng)估、骨骼肌光

4、鏡觀察及測(cè)定肌纖維橫截面平均Feret直徑，每小組6只。雙盲法采集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，變量以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用隨機(jī)單位組設(shè)計(jì)資料的三因素方差分析(three-way-ANOVA)，以p<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果：（1） P19細(xì)胞的誘導(dǎo)分化：經(jīng)RA誘導(dǎo)后P19細(xì)胞開始停止分裂，不貼壁而自動(dòng)聚成細(xì)胞團(tuán)樣生長。當(dāng)將經(jīng)RA誘導(dǎo)4天的P19細(xì)胞消化后繼續(xù)作單層培養(yǎng)，一些細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

5、類似于神經(jīng)元的形態(tài)，并開始長出1至2個(gè)突起，經(jīng)單層培養(yǎng)至第6天，大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴谏窠?jīng)元的形態(tài)，神經(jīng)元樣細(xì)胞長出的突起逐漸增多并延長，形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)樣結(jié)構(gòu)，培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞以橢圓形的雙極者為多見。（2） P19細(xì)胞移植和神經(jīng)生長因子局部注射防治大鼠神經(jīng)損傷后骨骼肌萎縮實(shí)驗(yàn)研究：SFI測(cè)定結(jié)果、腓腸肌肌濕重恢復(fù)率測(cè)定結(jié)果以及肌纖維平均Feret直徑測(cè)量結(jié)果均提示術(shù)后8周的療效高于4周，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)；同樣三種

6、測(cè)量方法也提示，B組的治療效果較A組有顯著提高(p<0.01)；SFI測(cè)定結(jié)果顯示，所采取的四種不同治療方案組內(nèi)均數(shù)無顯著性差異(p>0.05)，而腓腸肌肌濕重恢復(fù)率測(cè)定結(jié)果以及肌纖維平均Feret直徑測(cè)量結(jié)果均提示四種不同治療方案組內(nèi)均數(shù)有顯著性差異(p<0.01)，其中NGF組與聯(lián)合組的肌濕重回復(fù)率均顯著高于空白組與P19細(xì)胞移植組，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。骨骼肌光鏡觀察：術(shù)后4周，各組肌纖維細(xì)胞均發(fā)生了不同程度的萎

7、縮，橫截面均變小，邊界模糊，肌細(xì)胞形態(tài)欠規(guī)則，大小不一，間質(zhì)中纖維組織增生明顯，肌細(xì)胞中孔海姆區(qū)模糊，消失。肌纖維萎縮程度以A組較為嚴(yán)重。術(shù)后8周，A組的肌纖維萎縮仍然嚴(yán)重，與4周比較未見明顯的改變，但是，B組肌纖維的萎縮情況均略有好轉(zhuǎn)，其中，在NGF組與聯(lián)合組可見部分恢復(fù)的肌細(xì)胞孔海姆區(qū)。P19細(xì)胞的存活情況評(píng)估：術(shù)后4周與8周的連續(xù)切片均未發(fā)現(xiàn)有存活的細(xì)胞。 結(jié)論：(1) 體外經(jīng)RA成團(tuán)誘導(dǎo)培養(yǎng)的P19細(xì)胞可向神經(jīng)元方向分化