老年血虧陰虛失眠證候大鼠模型的建立及酸棗仁湯干預(yù)作用研究.pdf

1、目的：本課題結(jié)合臨床建立老年血虧陰虛型失眠證候動(dòng)物模型，并將該復(fù)合型模型與傳統(tǒng)單因素睡眠剝奪模型進(jìn)行對(duì)照，遵循中醫(yī)因-脈-證-治的思路進(jìn)行評(píng)價(jià)：首先對(duì)“因”進(jìn)行分析，即根據(jù)中醫(yī)病因病機(jī)來評(píng)價(jià)造模因素的科學(xué)性；然后對(duì)“脈”進(jìn)行觀測(cè)，即觀測(cè)模型較直接、直觀、重要的中醫(yī)體表特征，并確認(rèn)這種模型的證候?qū)傩?；接著?duì)“證”進(jìn)行探討，即通過分子生物學(xué)等現(xiàn)代科技手段對(duì)體表特征所反映的老年血虧陰虛型失眠病理機(jī)制進(jìn)行概括；最后用驗(yàn)方酸棗仁湯“治”來進(jìn)行反證

2、，探討對(duì)應(yīng)治法驗(yàn)方酸棗仁湯的作用及其可能機(jī)制，并建立基于代謝網(wǎng)絡(luò)變化的中藥復(fù)方系統(tǒng)生物學(xué)藥效評(píng)價(jià)平臺(tái)。 方法：在對(duì)酸棗仁湯的促眠作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究之后，將健康Wistar大鼠100只(雌雄各半、體重200g±20g)隨機(jī)分成5組，每組20只：環(huán)境對(duì)照組；睡眠剝奪組《單因素模型組)；證候模型組(復(fù)合因素模型組)；酸棗仁湯大劑量組；酸棗仁湯小劑量組．其中環(huán)境對(duì)照組給予其它組睡眠剝奪時(shí)相似的水環(huán)境；單因素模型組采用自制多平臺(tái)水環(huán)境法剝奪

3、睡眠48h劍備；復(fù)合因素模型組及酸棗仁湯大、小劑量組均采用頸背部皮下注射D-半乳糖6w、然后腹腔同時(shí)注射環(huán)磷酰胺和氫化可的松5d、接著用自制多平臺(tái)水環(huán)境法剝奪睡眠48h制備復(fù)合模型，造模歷時(shí)共7w；酸棗仁湯大、小劑量組在造模4w后開始同時(shí)灌胃給藥3w，其它組均給予等容積生理鹽水。指標(biāo)檢測(cè)具體方法如下： 1、通過同步檢測(cè)體重、攝食量、腋溫、及顯微放大拍照爪、尾、口唇等部位，對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠的中醫(yī)體表特征進(jìn)行比較； 2、用組織

4、化學(xué)法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦皮質(zhì)、海馬部位自由基和一氧化氮合酶(NOS)水平的變化； 3、采用血液細(xì)胞分析儀檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠血細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化； 4、采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變； 5、透射電鏡下觀察各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦皮質(zhì)部位超微結(jié)構(gòu)的病理改變； 6、采用高相液相法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位谷氨酸(Glu)及γ-氨基丁酸(GABA)含量的變化； 7、采用免疫組化

5、染色和mRNA半定量RT-PCR法檢測(cè)分析各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦皮質(zhì)及海馬部位γ-氨基丁酸A受體(GABAAR)a1和γ2亞單位的表達(dá)改變； 8、采用免疫組化染色法檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)大鼠大腦皮質(zhì)部位星形膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)改變。 結(jié)果： 1、與空白對(duì)照組比較，舒樂安定組、酸棗仁湯大、小劑量組均能顯著延長(zhǎng)閾上劑量戊巴比妥鈉致小鼠睡眠時(shí)間(P<0.01)，顯著增加閾下劑量戊巴比妥鈉致小鼠入睡率(P<0.01)。且酸棗仁湯大劑量組作用比

6、小劑量組更明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 2、中醫(yī)體表特征顯示，與環(huán)境對(duì)照組比較，睡眠剝奪組出現(xiàn)失眠癥狀，表現(xiàn)為重度疲勞狀態(tài)；與睡眠剝奪組比較，證候模型組在出現(xiàn)失眠癥狀的同時(shí)，出現(xiàn)面色無華，閉目，血呈暗紅，嗜睡，食欲明顯下降，四肢無力，毛蓬豎少光澤等血虧陰虛體表特征，且體重、攝食量顯著下降(P<0.01)，而腋溫的下降無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與證候模型組比較，酸棗仁湯大、小劑量組對(duì)血虧陰虛體表特征有改善作用，但無統(tǒng)

7、計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 3、與證候模型組比較，其它各組大鼠大腦皮質(zhì)、海馬丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和NOS活性均明顯降低(P<0.01，P<0.05)。且酸棗仁湯大、小劑量組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 4、與證候模型組比較，其它各組大鼠全血中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)及血紅蛋白含量顯著升高(P<0.01)。且酸棗仁湯大、小劑量組呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 5、在定位

8、航行實(shí)驗(yàn)中，與證候模型組比較，環(huán)境對(duì)照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠實(shí)驗(yàn)4d及2d的潛伏期均顯著縮短(P<0.01)。在空間搜索實(shí)驗(yàn)中，各組平臺(tái)象限的游泳距離占總距離百分比、池壁20％和40％區(qū)域游泳距離百分比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出與定位航行實(shí)驗(yàn)各組一致的趨勢(shì)；與證候模型組比較，環(huán)境對(duì)照組和酸棗仁湯大、小劑量組跨過原平臺(tái)位置次數(shù)明顯升高(P<0.01)。兩種模型組間相比無明顯差異(P>0.05)； 6、睡眠剝奪48h后，透射電鏡下顯示：

9、睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞異染質(zhì)輕微聚集，趨邊排列，核周間隙輕微增寬，大部分線粒體中高度水腫，線粒體基質(zhì)及線粒體脊消失；證候模型組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞間胞質(zhì)水腫，連接增寬，可見單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞異染質(zhì)凝聚，趨邊，呈現(xiàn)凋亡形態(tài)，細(xì)胞器消失：酸棗仁湯大、小劑量組能改善大鼠神經(jīng)元細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的病理改變； 7、與環(huán)境對(duì)照組比較，睡眠剝奪組大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、GABA含量均明顯增高(P<0.01)，但GAB

10、A增加更為明顯，Glu/GABA比例減?。慌c環(huán)境對(duì)照組比較，證候模型組大鼠Glu、GABA含量均明顯增高(P<0.01)，但Glu增加更為明顯，Glu/GABA比例增大；與證候模型組比較，酸棗仁湯大、小劑量組大鼠大腦皮質(zhì)及下丘腦部位氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)Glu、GABA含量顯著減少，但Glu減少更為明顯，Glu/GABA比例減小，并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系(P<0.05)； 8、與證候模型組比較，環(huán)境對(duì)照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠大腦皮質(zhì)及

11、海馬部位的GABAARa1和γ2亞單位免疫化學(xué)累積光密度明顯較低(P<0.01)，皮質(zhì)部位GABAARa1和γ2 mRNA的表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.01)．而與睡眠剝奪組比較，證候模型組表達(dá)相對(duì)較弱(P<0.05)； 9、與證候模型組比較，環(huán)境對(duì)照組和酸棗仁湯大、小劑量組大鼠睡眠剝奪48h后星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物—膠原纖維酸性蛋白(GFAP)在皮質(zhì)部位表達(dá)明顯較弱；與睡眠剝奪組比較，證候模型組表達(dá)亦相對(duì)較強(qiáng)。 結(jié)論：

12、 1、酸棗仁湯具有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用，且大劑量作用強(qiáng)于小劑量； 2、模型大鼠的體表特征顯示，D-半乳糖+環(huán)磷酰胺、氫化可的松+睡眠剝奪這一復(fù)合模型較接近臨床老年血虧陰虛型失眠患者的表現(xiàn)，是一種可行、可靠的復(fù)合型動(dòng)物模型； 3、老年大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和大腦皮質(zhì)病理損傷與睡眠剝奪、血虧陰虛證候具有相關(guān)性。自由基水平增加、全血象減少是老年血虧陰虛型失眠的病理機(jī)制之一。反證驗(yàn)方酸棗仁湯可有效改善證候模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及修復(fù)腦

13、損傷，其作用機(jī)理可能與抗自由基、補(bǔ)血作用有關(guān)； 4、大腦皮質(zhì)及下丘腦部位Glu，GABA含量及Glu/GABA比值均升高可能是老年血虧陰虛型失眠的神經(jīng)生物學(xué)病理機(jī)制。酸棗仁湯治療老年血虧陰虛型失眠的作用機(jī)制可能與通過下調(diào)大腦皮質(zhì)及下丘腦部位Glu、GABA的含量及Glu/GABA的比值來保護(hù)腦組織有關(guān)。 5、睡眠剝奪可明顯上調(diào)大鼠腦內(nèi)皮質(zhì)及海馬部位GABAARa1和γ2亞單位表達(dá)。酸棗仁湯治療老年血虧陰虛型失眠的作用機(jī)制