烏魯木齊縣2-14歲人群HBV病毒株變異及OBI生物標(biāo)志物研究.pdf

1、目的:探討中、小學(xué)生(7-14歲)及學(xué)齡前兒童（2-6歲）乙型肝炎病毒隱匿性感染(occult hepatitis B virus infection OBI)后S基因片段變異位點(diǎn)與OBI發(fā)生的關(guān)系;4種miRNA表達(dá)譜與OBI發(fā)生的關(guān)聯(lián)性;初步探討miRNA用于早期診斷OBI的可行性。
　　方法:用整群抽樣方法選擇烏魯木齊縣4所中、小學(xué)綜合性學(xué)校，對(duì)在校的學(xué)生采用酶聯(lián)免疫試劑法(ELISA)和化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行乙肝HBsAg、抗-H

2、Bs兩項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的HBsAg和抗-HBs2項(xiàng)指標(biāo)均為陰性的469名中、小學(xué)生的一份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取HBV-DNA產(chǎn)物，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增HBV-DNA S基因片段，對(duì)43份有目的條帶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HBV基因S區(qū)(544bp)序列測(cè)定。測(cè)序后建立HBV序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并用MEGA5軟件將測(cè)序結(jié)果與NCBI國(guó)際核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)協(xié)作組（INSDC，原Genbank）收錄的序列進(jìn)行對(duì)比分析，

3、以獲得HBV基因S區(qū)序列的核苷酸變異規(guī)律;基于S區(qū)基因片段的進(jìn)化模型選擇，測(cè)定序列與INSDC收錄的參考序列建立進(jìn)化樹，確定病毒的基因型，比較其基因型分布的差別，分析產(chǎn)生變異的核苷酸位點(diǎn)。40例序列測(cè)定成功的中、小學(xué)生按漢族，少數(shù)民族（包括漢族、哈族和回族）1∶1匹配，符合匹配條件的有20名學(xué)生，這20名學(xué)生作為OBI研究對(duì)象。在整群抽樣調(diào)查后，隨機(jī)選取與OBI組年齡、性別和族別相匹配的20名健康學(xué)生和20名HBsAg陽(yáng)性學(xué)生作為對(duì)照。

4、共計(jì)60份血清用QIAGEN公司的試劑盒提取RNA，轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定4種miRNA的相對(duì)表達(dá)量。用同樣的方法選擇4所幼兒園，對(duì)在園的學(xué)齡前兒童采用ELISA進(jìn)行HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe和anti-HBc5項(xiàng)檢測(cè)，對(duì)259例HBsAg陰性血清用Promega公司的試劑盒提取HBV-DNA產(chǎn)物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增HBV-DNA S基因片段，對(duì)發(fā)現(xiàn)的21份目的條帶進(jìn)行測(cè)序。用上述方法獲得

5、核苷酸變異規(guī)律，確定基因型。
　　結(jié)果:469份中、小學(xué)生血樣標(biāo)本中用PCR擴(kuò)增共發(fā)現(xiàn)43份HBV DNA剛性標(biāo)本。其中，40份測(cè)序成功，32例B基因型樣本均為adw2血清型，6例C基因型樣本5例為adrq+血清型，1例為ayw2血清型。2例D基因型樣本均為ayw2血清型。D基因型僅在哈薩克族學(xué)生中出現(xiàn)。S基因序列翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸后分別發(fā)生I110L、S113T、K122R、T126I、F134Y、T143S、K159G和K16

6、0R突變。S基因MHR區(qū)氨基酸變異在性別、民族中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4種miRNA在健康對(duì)照者與HBV感染者和健康對(duì)照者與OBI感染者血清中的表達(dá)，let-7c，miR-122和miR-150的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但miR-23b在血清中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，OBI感染者中，let-7c，miR-23b，miR-122和miR-150在漢族和少數(shù)民族血清中的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。OBI感染者的血清miRNA表達(dá)與S基因MHR區(qū)氨基酸變

7、異次數(shù)的相關(guān)關(guān)系均為負(fù)相關(guān)。let-7c，miR-122，miR-150和miR-23b與基因序列MHR區(qū)變異的突變次數(shù)的相關(guān)系數(shù)分別為-0.606，-0.902，-0.955和-0.897;P值分別為0.202，0.009，0.003和0.015.miR-122，miR-150，let-7c與S基因MHR區(qū)氨基酸變異次數(shù)顯著相關(guān)。在血清中表達(dá)有差異的3種miRNA區(qū)分OBI感染者和正常對(duì)照時(shí)，曲線下面積(Area under curv

8、e，AUC)為96.4％(靈敏性:92.6％，特異性:90.8％)。用受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)各miRNA時(shí)，體現(xiàn)出了一定的診斷價(jià)值。259份學(xué)齡前兒童血樣共發(fā)現(xiàn)21份HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)本，均測(cè)序成功。其中1例由于存在氨基酸插入，沒有檢測(cè)出具體基因型。其余20例樣本均為C基因型，其血清型均為adrq+亞型。S基因序列翻譯成氨基酸后分別發(fā)生I110L、S123T、T124S、T126I、T131N、F134Y和P142H突變。1