三小湯治療慢性阻塞性肺病的藥效學(xué)及臨床觀察.pdf

1、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種常見的多發(fā)的具有高致殘率和高致死率的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，以不完全可逆的氣流受限為特點(diǎn)。據(jù)研究，該病已排在當(dāng)前死亡原因的第4位，預(yù)計(jì)至2020年將成為世界疾病經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的第5位。感染、吸煙、大氣污染、職業(yè)性粉塵和有害氣體吸入等外界致病因素在易患個(gè)體導(dǎo)致氣道、肺實(shí)質(zhì)和肺血管的慢性炎癥。中性粒細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞通過

2、釋放多種生物活性物質(zhì)而參與該慢性炎癥的發(fā)生，通過不同環(huán)節(jié)促進(jìn)氣道慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展，如IL-1、IL-4、IL-8、TNF-α等。其中氣道粘液高分泌狀態(tài)和炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是COPD的重要原因之一，最終導(dǎo)致氣道阻塞和氣流受限。
　　 COPD可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“咳嗽”、“喘證”、“痰飲”、“肺脹”等病證范疇，乃本虛標(biāo)實(shí)之證，肺氣虛是其根本，痰濕水飲內(nèi)阻貫穿始終。張仲景《傷寒論》指出:“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳，或渴，或

3、利，或噎，或小便不利，少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之”?！皞南掠兴畾猓榷⒋?，發(fā)熱不渴。服湯已，渴者，此寒去欲解也，小青龍湯主之?！薄督饏T要略·痰飲咳嗽病脈證并治》中指出:“病溢飲者，當(dāng)發(fā)其汗，大青龍湯主之，小青龍湯亦主之?！薄翱饶嬉邢⒉坏门P，小青龍湯主之?！币虼耍∏帻垳侵委熗夂畠?nèi)飲證的重要方劑。小青龍湯組成為麻黃、桂枝、細(xì)辛、半夏、干姜、五味子、白芍、甘草。麻黃發(fā)汗、平喘、利水，配桂枝則增強(qiáng)通陽宜散之力;芍藥與桂枝配伍，調(diào)和營

4、衛(wèi);干姜大辛、大熱合細(xì)辛散寒溫肺化飲;五味子味酸性溫?cái)糠沃箍?，防諸辛散藥發(fā)散太過，耗傷正氣;半夏味辛性溫，降逆止嘔，燥濕祛痰;炙甘草調(diào)和諸藥。諸藥配合共奏溫里化飲，止咳平喘之功效。本方臨床多用于呼吸系統(tǒng)疾病，為后世治療咳喘的圣方。導(dǎo)師陳寶田教授延續(xù)古人經(jīng)驗(yàn)，通過辨證施治，自擬三小湯加味，在臨床中治療慢阻肺取得良好療效。三小湯是小青龍湯、小柴胡湯、小陷胸湯三方合并創(chuàng)立的新方。其中，小青龍湯是治療外寒內(nèi)飲的常用方劑。陳老認(rèn)為，慢性咳喘癥多有

5、血弱氣盡，腠理開，邪氣因入，與正氣相搏，結(jié)于脅下，故見小柴胡湯癥，尤以“胸脅苦滿，不欲飲食”多見。將三方合用治療慢性阻塞性肺病，切中病機(jī)，無論寒熱都可應(yīng)用，適應(yīng)癥廣。加用魚腥草清熱解毒。具體應(yīng)用時(shí)，因病位深淺、病情輕重、兼夾癥異同、并發(fā)癥多少而靈活加減用藥。
　　 本課題組構(gòu)建了慢阻肺的動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)觀察的基礎(chǔ)上證明三小湯對大鼠慢性阻塞性肺病模型具有止咳、平喘、化痰、抗過敏等療效。因?yàn)闅獾勒骋焊叻置跔顟B(tài)和炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是COPD

6、發(fā)病的重要原因之一。所以我們在藥效學(xué)的基礎(chǔ)上，根據(jù)引起慢阻肺的重要發(fā)病原因，進(jìn)一步研究三小湯治療慢阻肺的相關(guān)藥理機(jī)制。
　　 白細(xì)胞介素-4（白介素-4，Interleukin-4，IL-4）是Ⅱ型輔助T細(xì)胞（Th2細(xì)胞）分泌的細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素-4的生物作用，包括刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、CD4+T細(xì)胞分化成Ⅱ型輔助T細(xì)胞。IL-4可能通過調(diào)節(jié)嗜酸粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)、促進(jìn)氣道纖維化、誘導(dǎo)氣道黏液高分泌和氣道高反應(yīng)性(AHR)

7、等途徑參與COPD的發(fā)病。
　　 白細(xì)胞介素-8（白介素-8，Interleukin-8，IL-8）是細(xì)胞趨化因子家族中的主要組分，是許多炎性疾病的重要介質(zhì)，與COPD的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，是COPD病情監(jiān)測和療效判斷的較好指標(biāo)。
　　 TNF-α是一種具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細(xì)胞因子，吸煙等多種COPD的危險(xiǎn)因素導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞受損，TNF-α分泌增加，促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化和活化，導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)破壞。有研究提示多種因素導(dǎo)

8、致COPD患者血清TNF-α水平升高。
　　 水通道蛋白(aquaporins waterchannel protein，AQPs)是一種膜通道蛋白家族，負(fù)責(zé)生物體內(nèi)多種組織和細(xì)胞的水的快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。AQP1主要在氣道周圍毛細(xì)血管、淋巴管及肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和臟層胸膜間皮細(xì)胞上表達(dá)。本研究中通過檢測水通道蛋白1(AQP1)在肺中的表達(dá)情況了解三小湯對改善肺水腫的作用。
　　 我們試圖通過觀察影響慢性阻塞性肺病發(fā)病的3個(gè)

9、重要的指標(biāo):白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-8、腫瘤壞死因子觀察三小湯可能的作用機(jī)制。同時(shí)觀察三小湯對慢阻肺大鼠的咳嗽和呼吸頻率、氣管直徑及觀察肺部病理圖片，從而推斷三小湯對慢阻肺大鼠模型的止咳、平喘、抗過敏等藥效學(xué)作用，具備創(chuàng)新性。我們希望通過以上實(shí)驗(yàn)研究能為該藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)觀察三小湯治療慢性阻塞性肺病患者臨床癥狀的改善程度及安全性評價(jià)。
　　 第一部分大鼠慢性阻塞性肺病模型的建立及三小湯的干預(yù)作用
　　 研究目

10、的
　　 研究三小湯治療慢性阻塞性肺病的藥效學(xué)。構(gòu)建Wistar大鼠慢性阻塞性肺病的模型;觀察三小湯不同劑量對慢性阻塞性肺病大鼠咳嗽、呼吸、肺泡灌洗液有核細(xì)胞百分率、血清細(xì)胞因子及肺內(nèi)支氣管擴(kuò)張、水通道蛋白表達(dá)情況的影響。
　　 研究方法
　　 1清潔級健康Wistar大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性對照組（沐舒坦組），每組8只。
　　 2采用氣管注脂多糖

11、加熏煙方法構(gòu)建慢性阻塞性肺病模型，4周后造模完成。各組分別給予不同處理，三小湯高劑量組(10g/kg)，三小湯中劑量組(5g/kg)，三小湯低劑量組(2.5g/kg)，沐舒坦片西藥對照組(10.4mg/kg)，模型對照組（生理鹽水）和正常的對照組（生理鹽水），自由飲食。
　　 3藥物治療過程中及治療后1周觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單位時(shí)間內(nèi)咳嗽和呼吸頻率。
　　 4處死大鼠，抽取肺泡灌洗液檢測各種有核細(xì)胞百分率，進(jìn)一步分析抗過敏效應(yīng)。

12、
　　 5常規(guī)肺組織切片，檢查支氣管擴(kuò)張水平。
　　 6采用大鼠IL-4、IL-8、TNF-a ELISA試劑盒檢測大鼠血清內(nèi)IL-4、IL-8、TNF-a的含量。
　　 7采用Envision二步法免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測水通道蛋白1(AQP1)在肺組織中的表達(dá)。
　　 8統(tǒng)計(jì)方法
　　 (1)計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;
　　 (2)不同分組用藥前及用藥后各組間比較應(yīng)用SPSS13.0

13、統(tǒng)計(jì)軟件包采用one-way ANOVA方法分析及組間比較采用LSD法，如方差不齊則選擇近似F檢驗(yàn)Welch法，及Dunnett's T3組間比較。各組大鼠給藥前后咳嗽頻率、呼吸頻率比較采用協(xié)方差分析;以P＜0.05為差異有顯著性。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1造模1周后各組大鼠出現(xiàn)明顯的咳嗽、呼吸急促癥狀。
　　 2給藥前三小湯低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組、模型組咳嗽頻率(F=0.220，P=0.925

14、)、呼吸頻率(F=6.879，P=0.000)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示造模后大鼠的癥狀顯著，造模成功。給藥后整體組間咳嗽頻率(F=49.040，P=0.000)、呼吸頻率(F=12.990，P=0.000)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三小湯高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性對照組與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三小湯可改善慢性阻塞性肺病大鼠的咳嗽和呼吸急促。
　　 3治療后1周各

15、組大鼠肺泡灌洗液中淋巴細(xì)胞百分率(F=15.091，P=0.000)、中性粒細(xì)胞百分率(F=11.534，P=0.000)、嗜酸性粒細(xì)胞百分率(F=3.045，P=0.020)、嗜堿性粒細(xì)胞百分率(F=2.479，P=0.047)整體組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三小湯可有效降低肺內(nèi)升高的有核細(xì)胞百分率，減輕過敏反應(yīng)。
　　 4肺組織支氣管擴(kuò)張整體組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=18.557，P=0.000)，三小湯低劑量組、

16、中劑量組、高劑量組、陽性對照組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，P=0.000，P=0.000，P=0.000)，提示三小湯可有效減輕慢性阻塞性肺病大鼠肺內(nèi)支氣管擴(kuò)張水平。
　　 5給藥后各組大鼠血清中IL-4含量(F=15.078，P=0.000)、IL-8含量(F=29.442，P=0.000)、TNF-a含量(F=18.648，P=0.000)整體組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三小湯低劑量組、中劑量組、高劑量

17、組、陽性對照組、正常組與模型組比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三小湯可有效降低血清IL-4、IL-8、TNF-a的含量，減輕炎癥反應(yīng)。
　　 6水通道蛋白1(AQP1)在肺中的陽性表達(dá)情況整體組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.382，P=0.000)，三小湯低劑量組、中劑量組、高劑量組、陽性對照組與模型組比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示三小湯有效促進(jìn)水通道蛋白1(AQP1)在肺中的表達(dá)上調(diào)，從而增加清除和轉(zhuǎn)運(yùn)肺水，改善水液代謝，減輕

18、肺水腫狀態(tài)，有效保護(hù)急性肺損傷。
　　 討論
　　 三小湯中藥可以有效改善慢性阻塞性肺病的相關(guān)臨床癥狀，降低肺內(nèi)有核細(xì)胞的比例，減輕過敏反應(yīng)，有效改善體內(nèi)IL-4、IL-8、TNF-a細(xì)胞因子含量，降低炎癥反應(yīng)，可以減輕肺組織中支氣管擴(kuò)張狀況并促進(jìn)水通道蛋白1的表達(dá)上調(diào)，從而增加清除和轉(zhuǎn)運(yùn)肺水，改善水液代謝，減輕肺水腫狀態(tài)以減輕肺組織損傷。
　　 第二部分三小湯的臨床療效觀察
　　 研究目的
　　

19、 觀察三小湯治療慢性阻塞性肺病患者臨床癥狀的改善程度及安全性評價(jià)。
　　 研究方法
　　 所有病例符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸系病學(xué)會(huì)制定的《慢性阻塞性肺疾病診治指南（2007年修訂版）》診斷標(biāo)準(zhǔn);病例來源于南方醫(yī)院中醫(yī)科、呼吸內(nèi)科的門診和病房，性別不限，年齡在48歲-70歲，共60例，隨機(jī)分為對照組和觀察組，每組30例。對照組給予臥床休息、抗感染、擴(kuò)張支氣管、降低氣道阻力、糖皮質(zhì)激素、化痰等常規(guī)西醫(yī)治療，觀察組在對照組治療的基礎(chǔ)

20、上加用三小湯加味。
　　 三小湯:細(xì)辛10g，半夏10g，甘草10g，五味子10g，干姜10g，桂枝10g，麻黃10g，白芍10g，柴胡20g，黃芩15g，黨參10g，生姜10g，大棗10g，黃連10g，瓜萎30g，魚腥草30g。
　　 治療前后兩組均做三大常規(guī)、肝功能、腎功能檢查。根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》對臨床癥狀進(jìn)行評定。
　　 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)士標(biāo)

21、準(zhǔn)差（(x)±s）表示。兩組治療療效比較用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，治療后血清細(xì)胞因子含量比較應(yīng)用協(xié)方差分析，治療前后各組均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，方差齊時(shí)多重比較采用LSD-t法檢驗(yàn);方差不齊時(shí)，用近似方差分析的Welch法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1用藥14天后，觀察組和對照組的總有效率分別為93.33％和73.33％，觀察組療效明顯優(yōu)于對照組，兩組

22、比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039)，提示在常規(guī)西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上加用三小湯加味，可以更加有效的改善慢性阻塞性肺病患者的臨床癥狀，提高生活質(zhì)量。
　　 2三小湯+常規(guī)西醫(yī)治療慢性阻塞性肺病與單純常規(guī)西醫(yī)治療慢性阻塞性肺病治療前兩組血清IL-4、IL-8、TNF-a含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后IL-4(F=10.874, P=0.002)、IL-8(F=378.696, P=0.000)、TNF-a(F=404.358,P=