SRC-1在雄激素調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶中的作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、眾所周知,雄激素對(duì)腦的結(jié)構(gòu)和功能有多方面重要的調(diào)節(jié)作用,但是具體機(jī)制尚不清楚。在人類,老化相關(guān)的雄激素水平下降與認(rèn)知障礙有關(guān)且是老年癡呆的危險(xiǎn)因子,流行病學(xué)研究表明老年群體中較低雄激素水平的人群其認(rèn)知功能同樣也較低且更容易發(fā)展為老年癡呆。來自動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明雄激素參與調(diào)節(jié)腦的結(jié)構(gòu)與功能的性別差異,特別是情緒、認(rèn)知、學(xué)習(xí)記憶以及生殖功能等。在腦內(nèi),雄激素發(fā)揮作用可以有兩種方式,一是通過其受體的直接方式,另一種為通過芳香化酶(aromat

2、ase,AROM)催化將其轉(zhuǎn)化為雌激素(通常稱為local estrogen即內(nèi)源性雌激素,主要是雌二醇estradiol, E2)的間接方式,根據(jù)芳香化酶假說該方式直接決定了腦發(fā)育的性別差異。在直接方式中,雄激素與相應(yīng)的受體即雄激素受體(androgen receptor, AR)結(jié)合進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在間接方式中,經(jīng)由AROM催化雄激素轉(zhuǎn)化而來的E2可通過其核受體(estrogen receptorα和β, ERα和ERβ)結(jié)合

3、發(fā)揮經(jīng)典的基因型調(diào)節(jié)效應(yīng),即調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的方式;或通過其與G蛋白耦聯(lián)的、位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)如線粒體的膜性受體(G-protein coupled membranous estrogen receptor, GPER)結(jié)合進(jìn)而通過胞漿內(nèi)的第二信使系統(tǒng)發(fā)揮“非經(jīng)典的”、產(chǎn)生快速生理效應(yīng)的非基因型效應(yīng)。經(jīng)典的類固醇激素受體包括AR、ERα和ERβ都位于細(xì)胞核內(nèi),屬于核受體超家族成員,然而近年來的研究發(fā)現(xiàn)多種經(jīng)典的核受體在某些情況

4、下也可位于胞漿甚至細(xì)胞膜且能通過第二信使系統(tǒng)發(fā)揮快速的非基因型調(diào)節(jié)作用,因此無論是雄激素還是雌激素,其具體的作用機(jī)制都非常復(fù)雜。目前認(rèn)為,類固醇激素通過核受體調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的方式是類固醇激素發(fā)揮作用的主要方式。在此過程中的基本調(diào)節(jié)模式是:激素與核受體結(jié)合,捕獲輔助活化因子(coactivator)或輔助抑制因子(corepressor),再捕獲其它的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子與RNA聚合酶等多種轉(zhuǎn)錄所需元件,導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄開始。
　　已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種

5、輔助活化因子,它們分別在不同的組織、器官或細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用,目前對(duì)p160家族研究得最多最深入。該家族包括三個(gè)成員,即類固醇受體輔助活化因子-1(steroid receptor coactivator-1, SRC-1)、SRC-2和SRC-3,其分子量均為160kDa。SRC-1主要見于腦內(nèi),SRC-2和 SRC-3主要見于外周組織,其中 SRC-1是發(fā)現(xiàn)最早、腦內(nèi)分布最廣的類固醇受體輔助活化因子,敲除該基因?qū)е逻\(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)障礙和小腦浦肯

6、野細(xì)胞發(fā)育延遲,下丘腦注射SRC-1反義寡核苷酸證明它參與了對(duì)生殖功能的調(diào)控,但是到目前為止它在腦內(nèi)的功能總體來說還很不清楚。前人的研究報(bào)道了SRC-1蛋白高表達(dá)于海馬神經(jīng)元內(nèi),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)很少甚至不表達(dá);我們前期工作報(bào)道了腦內(nèi)SRC-1蛋白的表達(dá)具有明顯的性別差異,在雄性小鼠的多數(shù)腦區(qū)其表達(dá)都顯著高于雌性的對(duì)應(yīng)腦區(qū);我們還報(bào)道其表達(dá)隨老化而降低,且主要見于與學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)等有關(guān)的腦區(qū)如海馬、黑質(zhì)等。由于海馬是與學(xué)習(xí)記憶、情緒和

7、認(rèn)知關(guān)系最密切的腦區(qū),海馬的突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ),前人和我們的前期工作都顯示海馬內(nèi)有高水平的 SRC-1蛋白表達(dá),推測(cè)它可能參與了性激素對(duì)海馬功能特別是突觸可塑性的調(diào)節(jié),為此我們采用性腺切除實(shí)驗(yàn)初步探討了性激素對(duì)海馬SRC-1表達(dá)的影響,意外地觀察到卵巢切除僅短時(shí)影響海馬SRC-1的表達(dá),而睪丸切除后海馬SRC-1的表達(dá)持續(xù)顯著降低,強(qiáng)烈提示SRC-1可能主要參與了睪丸雄激素而不是卵巢雌激素對(duì)海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié),然而SRC-1是

8、否或如何介導(dǎo)雄激素對(duì)海馬結(jié)構(gòu)與功能的調(diào)節(jié)尚未見任何文獻(xiàn)報(bào)道。
　　有鑒于此,本課題研究采用免疫組織化學(xué)、Western blot、透射電鏡、Morris水迷宮、RNA干擾、免疫共沉淀等技術(shù)方法,首先檢測(cè)了睪丸切除或芳香化酶抑制劑處理后全腦內(nèi)各腦區(qū)SRC-1的表達(dá)變化,為進(jìn)一步研究SRC-1可能參與了雄激素或內(nèi)源性雌激素的哪些功能提供線索;然后采用睪丸切除(Orchiectomy, ORX)和/或芳香化酶抑制劑來曲唑(Letrozo

9、le, LET)處理觀察海馬SRC-1表達(dá)與突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶改變之間的相關(guān)性;接下來進(jìn)一步通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)抑制海馬SRC-1表達(dá)后檢測(cè)了小鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬突觸可塑性的變化;最后用小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞株的體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SRC-1對(duì)突觸蛋白的抑制并對(duì)其可能機(jī)制進(jìn)行了初步研究,主要結(jié)果如下:
　　1.SRC-1免疫陽性產(chǎn)物在成年雄性小鼠大腦的端腦、間腦、腦干和小腦等腦區(qū)廣泛表達(dá),主要定位于細(xì)胞核。ORX處理1個(gè)月后梨狀皮質(zhì)、嗅結(jié)節(jié)、

10、海馬、下丘腦背外側(cè)核、腹外側(cè)核及黑質(zhì)等部位SRC-1蛋白的表達(dá)水平顯著下降; LET處理1個(gè)月后隔內(nèi)側(cè)核、海馬、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、上丘、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)以及上橄欖旁核等核團(tuán)內(nèi)SRC-1蛋白表達(dá)水平顯著下降。
　　2.ORX和LET處理1個(gè)月后海馬SRC-1及突觸可塑性相關(guān)蛋白谷氨酸受體GluR1、突觸后密度蛋白-95(PSD-95)、樹突棘素(Spinophilin)的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低,且變化模式高度相關(guān);LET處

11、理對(duì)SRC-1和突觸蛋白的抑制較ORX處理更顯著。透射電鏡結(jié)果顯示ORX和LET均能調(diào)節(jié)海馬CA1區(qū)的突觸密度與突觸形態(tài),但是LET較ORX的作用更強(qiáng);而Morris水迷宮測(cè)試中,LET能夠顯著增加雄性小鼠的潛伏期,同時(shí)降低在目標(biāo)象限的停留時(shí)間,而ORX對(duì)學(xué)習(xí)記憶行為無影響。
　　3.ORX后再給予LET的聯(lián)合處理與單獨(dú)應(yīng)用LET的效果一致,并未引起海馬突觸蛋白表達(dá)、突觸密度的進(jìn)一步降低以及更嚴(yán)重的學(xué)習(xí)記憶障礙。
　　4.立

12、體定位注射SRC-1 shRNA慢病毒可顯著抑制海馬SRC-1表達(dá),并顯著下調(diào)突觸蛋白GluR1、PSD-95、spinophilin以及ERα、ERβ、AR的表達(dá);海馬CA1區(qū)棘突觸密度及突觸后致密物的厚度顯著降低; Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明小鼠有顯著的空間學(xué)習(xí)記憶能力下降。
　　5.小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞株mHippoE-14可表達(dá)神經(jīng)元的各種標(biāo)記物、多種突觸蛋白以及核受體和SRC-1。體外培養(yǎng)的mHippoE-14細(xì)胞用SRC

13、-1 shRNA抑制SRC-1表達(dá)后同樣可下調(diào) GluR1、PSD-95、Spinophilin等突觸蛋白表達(dá)以及磷酸化 CREB的水平;免疫共沉淀結(jié)果顯示SRC-1與磷酸化CREB存在直接的相互結(jié)合關(guān)系,且SRC-1表達(dá)受到抑制后其與磷酸化CREB相互結(jié)合的作用力顯著降低。
　　主要結(jié)論:
　　1.ORX和LET均可顯著降低多個(gè)腦區(qū)內(nèi)SRC-1的表達(dá),表明SRC-1可介導(dǎo)睪丸雄激素和內(nèi)源性雌激素對(duì)腦的結(jié)構(gòu)和功能多方面的調(diào)節(jié)

14、。在與學(xué)習(xí)記憶、運(yùn)動(dòng)、神經(jīng)內(nèi)分泌、生殖和神經(jīng)信息整合有關(guān)的腦區(qū)如基底前腦、海馬、下丘腦、中腦,兩種處理導(dǎo)致SRC-1的降低都很明顯,強(qiáng)烈提示SRC-1介導(dǎo)了雄激素對(duì)這些核團(tuán)的直接或間接效應(yīng)。
　　2.ORX或LET對(duì)海馬的SRC-1表達(dá)和突觸可塑性均有一定的調(diào)節(jié)作用,以LET的效應(yīng)更明顯;行為學(xué)測(cè)試顯示僅LET可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶行為的改變,表明內(nèi)源性雌激素比循環(huán)雄激素對(duì)海馬SRC-1和學(xué)習(xí)記憶的影響更顯著。
　　3.ORX+LE

15、T聯(lián)合處理不能導(dǎo)致突觸可塑性的進(jìn)一步下降,可能是LET處理導(dǎo)致的內(nèi)源性雌激素水平或 SRC-1表達(dá)的下降達(dá)到了某種“閾值”、因而 ORX后給予LET處理并未能進(jìn)一步引起突觸蛋白表達(dá)、突觸密度的降低以及學(xué)習(xí)記憶行為的變化,同樣表明內(nèi)源性雌激素對(duì)調(diào)節(jié)海馬SRC-1的表達(dá)、突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的重要性。
　　4.在體應(yīng)用SRC-1 shRNA慢病毒抑制海馬神經(jīng)元SRC-1表達(dá)后突觸可塑性的顯著下降和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。離體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步

16、證實(shí)了抑制神經(jīng)元SRC-1表達(dá)可導(dǎo)致突觸蛋白表達(dá)的顯著下降以及磷酸化 CREB水平的下降。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SRC-1和磷酸化 CREB能相互作用且受到 SRC-1表達(dá)水平的調(diào)節(jié),提示 SRC-1能捕獲磷酸化CREB進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸蛋白基因的轉(zhuǎn)錄,最終對(duì)學(xué)習(xí)記憶行為產(chǎn)生深刻影響。
　　本課題通過一系列實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)SRC-1介導(dǎo)了雄激素對(duì)海馬的突觸可塑性以及學(xué)習(xí)記憶行為的調(diào)節(jié)作用,并初步探討可能的調(diào)節(jié)機(jī)制,同時(shí)我們還注意到內(nèi)源性雌激

17、素在調(diào)控海馬突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶方面可能具有較雄激素更重要的作用。本課題的研究為進(jìn)一步深入闡明SRC-1在腦內(nèi)的表達(dá)與功能提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù),為開發(fā)預(yù)防和治療學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知障礙的藥物提供了新的靶點(diǎn)。由于老化相關(guān)的雄激素水平下降與認(rèn)知障礙有關(guān)且是老年癡呆的危險(xiǎn)因子,激素替代治療包括雄激素替代和雌激素替代已經(jīng)開始臨床實(shí)驗(yàn),用于預(yù)防或改善老化相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)以及帕金森病(Pa