利用SpliT-Intein內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白功能恢復(fù)創(chuàng)建雙組分雄性不育系的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目前盡管通過基因工程手段已經(jīng)實現(xiàn)了植物細胞核不育,但得到的不育系與相應(yīng)保持系雜交后僅能得到50%的不育株,其余50%的可育株需要去除。如何獲得不育率為100%的核不育系是目前雄性不育研究的重點。為實現(xiàn)上述目的,本研究將毒蛋白基因Barnase和草甘膦抗性基因G2-EPSPS分拆為無活性的N端和C端兩個片段并分別與Ssp DnaE內(nèi)含肽和Npu DnaE內(nèi)含肽的N端和C端融合,分別構(gòu)建pCABarESN、pCABarESC、pCABarS

2、NZESN、pCABarSCZESC植物表達載體以及pCABarESP、pCABarABn兩個對照載體。分別將其導(dǎo)入芥菜和甘藍植株,研究利用Split-Intein內(nèi)含肽介導(dǎo)分拆蛋白結(jié)構(gòu)和功能重建實現(xiàn)100%雄性不育的可行性。本研究主要內(nèi)容包括:
  ⑴芥菜中實現(xiàn)了Npu DnaE內(nèi)含肽介導(dǎo)split-EPSPS基因功能重建。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,將pCABarESN、pCABarESC載體以及對照載體pCABarESP分別轉(zhuǎn)化芥菜,

3、獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因芥菜植株。經(jīng)PCR,RT-PCR分析結(jié)果顯示ESN、ESC、G2-EPSPS基因已轉(zhuǎn)入芥菜植株并表達。PPT抗性篩選結(jié)果顯示,部分pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因植株中的ESN、ESC基因為多個位點插入芥菜基因組。草甘膦抗性篩選結(jié)果表明,僅表達G2-EPSPS基因N端和C端片段的pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因芥菜植株不具有草甘膦抗性,表達G2-EPSPS基因完整序列的pCABarESP轉(zhuǎn)基因芥菜

4、植株具有草甘膦抗性。而pCABarESN、pCABarESC轉(zhuǎn)基因芥菜植株雜交后代因Npu DnaE內(nèi)含肽的介導(dǎo)的G2-EPSPS蛋白結(jié)構(gòu)和功能重建,植物具有草甘膦抗性。
 ?、偏@得了芥菜雙組分雄性不育親本植株。將pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表達載體轉(zhuǎn)入芥菜植株,獲得具有PPT抗性的芥菜植株雙組分雄性不育親本植株,經(jīng)PCR檢測目的基因已整合到芥菜基因組中。
 ?、谦@得了轉(zhuǎn)基因雄性不育甘藍植株。BcA

5、9驅(qū)動下的核糖核酸酶Barnase基因植物表達載體pCABarABn,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸轉(zhuǎn)化導(dǎo)入甘藍材料‘TF’,獲得具有除草劑Basta抗性的甘藍轉(zhuǎn)基因植株。細胞學(xué)觀察顯示,轉(zhuǎn)基因甘藍植株的花藥因絨氈層細胞提前降解,花粉母細胞退化,成熟花藥中無正常花粉粒產(chǎn)生。相對非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?,轉(zhuǎn)基因甘藍植株花器官變小,花瓣褶皺多,柱頭彎曲,雄蕊瘦小等現(xiàn)象。另外,轉(zhuǎn)基因植株在溫度低于22℃時出現(xiàn)明顯的死蕾現(xiàn)象,當溫度高于25℃時,死蕾現(xiàn)象得到緩解。

6、田間結(jié)實情況調(diào)查顯示,轉(zhuǎn)基因甘藍植株自交不能結(jié)實,與野生型雜交可結(jié)實但種莢變短。
  ⑷獲得了甘藍雙組分雄性不育親本植株。將pCABarSNZESN、pCABarSCZESC植物表達載體轉(zhuǎn)入甘藍植株,獲得具有PPT抗性的甘藍雙組分雄性不育親本植株,經(jīng)PCR檢測目的基因已整合到甘藍基因組中,RT-PCR分析結(jié)果顯示,ESN、ESC基因在pCABarSNZESN、pCABarSCZESC轉(zhuǎn)基因甘藍葉片中正常表達;SN、SC基因在pCA

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