基于腸易激綜合征模型的戊己丸藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、背景及目的：戊己丸是臨床上治療腸易激綜合征（Irritable bowel syndrome，IBS）的有效方劑，由黃連、制吳茱萸和土炒白芍組成，其中黃連為君藥，制吳茱萸和土炒白芍為臣藥。本課題組前期的戊己丸的藥代動(dòng)力學(xué)(Pharmacokinetic，PK)研究是在正常動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的，而未研究其在病理狀態(tài)下的PK。鑒于藥物主要是作用于病理狀態(tài)的機(jī)體，故研究病理狀態(tài)下的PK更有意義。此外，IBS是一種腸道功能紊亂但胃腸道結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常的

2、疾病，而且腸道的IBS病理狀態(tài)對(duì)于藥物吸收的影響還不得而知。因此本課題旨在利用炎癥后IBS(PI-IBS)和慢性內(nèi)臟高敏感IBS(CVH-IBS)大鼠模型，采用UPLC-MS/MS的技術(shù)，比較鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品（小檗堿）、黃連（小檗堿和巴馬?。?、戊己丸（小檗堿、巴馬汀、吳茱萸堿、吳茱萸次堿和芍藥苷）單次給藥后，代表成分在正常大鼠和以上兩種IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。在此基礎(chǔ)上，又比較了戊己丸單次以及多次給藥后，5個(gè)代表成分在正常大鼠和兩

3、種IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異，并應(yīng)用免疫組化和免疫熒光技術(shù)，從大鼠結(jié)腸中的緊密連接蛋白（Occludin和ZO-1）、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（P-gp、MRP1和MRP2）的角度探討戊己丸代表成分PK差異的原因。
　　方法和內(nèi)容：
　　1.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定血漿中戊己丸五個(gè)代表成分含量的方法學(xué)研究采用蛋白沉淀法對(duì)血漿進(jìn)行樣品前處理，建立同時(shí)測(cè)定血漿中戊己丸中的5個(gè)代表成分含量的UPLC-MS/

4、MS方法。
　　2.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較首先采用乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法建立PI-IBS大鼠模型，以大鼠的結(jié)腸運(yùn)動(dòng)、2h的排便糞粒數(shù)、玻璃小球排出時(shí)間為觀測(cè)指標(biāo)，同時(shí)通過(guò)HE染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察大鼠結(jié)腸的病理變化以及肥大細(xì)胞的數(shù)量變化對(duì)所建立的PI-IBS大鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。待模型成功后，分別給正常大鼠及模型大鼠行頸靜脈插管手術(shù)，術(shù)后12h，通過(guò)插管采血0

5、.2mL于肝素化的EP管中，同時(shí)通過(guò)插管補(bǔ)充0.2mL的肝素鈉溶液(50IU/mL)。然后，分別灌胃給予鹽酸小檗堿（25mg/kg，相當(dāng)于小檗堿22mg/kg)、黃連提取物(96mg/kg，分別相當(dāng)于小檗堿22 mg/kg和巴馬汀5.3mg/kg)、戊己丸(157.4 mg/kg，分別相當(dāng)于小檗堿22 mg/kg、巴馬汀5.3 mg/kg、吳茱萸堿0.055 mg/kg、吳茱萸次堿0.07 mg/kg和芍藥苷6.265 mg/kg)，并

6、于給藥后5 min、15 min、30 min、1h、1.5 h、2h、3h、4h、6h、8h、10h、12h、24 h、36h通過(guò)插管采血0.2mL于肝素化的EP管中，同時(shí)通過(guò)插管補(bǔ)充0.2mL的肝素鈉溶液(50IU/mL)。離心，取血漿100μL，凍存于-80℃。然后采用UPLC-MS/MS技術(shù)測(cè)定代表成分的含量。繪制藥時(shí)曲線，并利用WinNonlin軟件計(jì)算藥代參數(shù)(T1/2、Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F)

7、，比較各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。
　　3.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較首先采用乳鼠結(jié)腸PTCA球囊刺激的方法建立CVH-IBS大鼠模型，以大鼠的每周體重變化、腹部抬起和弓背抬高閾值為觀測(cè)指標(biāo)，通過(guò)HE染色和甲苯胺藍(lán)染色觀察大鼠結(jié)腸的病理變化及肥大細(xì)胞的數(shù)量變化，而且應(yīng)用免疫組化技術(shù)分析結(jié)腸中的原癌基因c-fos表達(dá)的變化對(duì)所建立

8、的CVH-IBS大鼠模型進(jìn)行評(píng)價(jià)。待模型成功后，同2.2方法給藥、取血漿、測(cè)定代表成分含量，繪制藥時(shí)曲線，并利用WinNonlin軟件計(jì)算藥代參數(shù)（T1/2、 Tmax、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F），比較各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異。
　　4.戊己丸單次給藥及多次給藥后，5個(gè)代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較及其機(jī)制研究按“2.2”方法建立PI-IBS大鼠模型

9、。待模型成功后，分別用于戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。單次給藥時(shí)，給大鼠灌胃戊己丸(629.6mg/kg，分別相當(dāng)于小檗堿88 mg/kg、巴馬汀21.1 mg/kg、吳茱萸堿0.22 mg/kg、吳茱萸次堿0.28 mg/kg和芍藥苷25.1 mg/kg);對(duì)于多次給藥，連續(xù)給藥6天，每天一次，給藥量同單次給藥，在第6天給藥后12h，對(duì)各大鼠行頸靜脈插管，術(shù)后12h后，給大鼠灌胃戊己丸(629.6 mg/kg，分別相

10、當(dāng)于小檗堿88 mg/kg、巴馬汀21.1mg/kg、吳茱萸堿0.22 mg/kg、吳茱萸次堿0.28 mg/kg和芍藥苷25.1mg/kg)，并于給藥后按“2.2”所示時(shí)間點(diǎn)取血漿，然后用“2.1”所建立的方法檢測(cè)5個(gè)代表成分的含量。繪制藥時(shí)曲線，并利用WinNonlin軟件計(jì)算藥代參數(shù)（T1/2、Tmax、 Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F），然后比較戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥各代表成分的藥代參數(shù)在正常組和模型組的差異

11、。36h的采血點(diǎn)完畢后，處死大鼠，迅速取兩段結(jié)腸，一段固定到2.5％的戊二醛溶液中，另一段固定到4％的多聚甲醛中，石蠟包埋切片。首先采用透射電鏡觀察大鼠結(jié)腸上皮緊密連接的超微結(jié)構(gòu)，然后采用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)大鼠結(jié)腸中的緊密連接蛋白(Occludin和ZO-1)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（P-gp、MRP1和MRP2）的表達(dá)，探討戊己丸中的5個(gè)代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的PK差異的機(jī)制。
　　

12、5.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較及其機(jī)制研究按“2.3”方法建立CVH-IBS大鼠模型。待模型成功后，分別按照“2.4”方法研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)差異及其機(jī)制研究。
　　結(jié)果：
　　1.UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定血漿中戊己丸5個(gè)代表成分含量的方法學(xué)研究本文建立的UPLC-MS/MS法可同時(shí)測(cè)定血漿中的戊己丸5個(gè)

13、代表成分的含量，方法專屬性好，靈敏準(zhǔn)確。
　　2.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較本實(shí)驗(yàn)采用乙酸聯(lián)合束縛應(yīng)激的方法建立的PI-IBS模型大鼠體重略微下降、結(jié)腸運(yùn)動(dòng)障礙、排便異常、肥大細(xì)胞數(shù)目顯著增多，較好的模擬了臨床上PI-IBS的癥狀，可以作為PI-IBS的動(dòng)物模型用于科學(xué)研究。
　　通過(guò)對(duì)鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸的代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體

14、內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)給予鹽酸小檗堿后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低。(2)灌胃黃連提取物后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低，而巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，其他的藥代參數(shù)未見(jiàn)顯著差異。除此之外，在模型大鼠體內(nèi)，小檗堿和巴馬汀均出現(xiàn)了雙峰。(3)給予戊己丸后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cma

15、x和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，T1/2和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低。
　　3.鹽酸小檗堿、黃連和戊己丸分別給藥后，各代表成分在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較本實(shí)驗(yàn)采用乳鼠結(jié)腸PTCA球囊刺激的方法建立的CVH-IBS大鼠模型表現(xiàn)出了內(nèi)臟痛覺(jué)超敏、肥大細(xì)胞顯

16、著增多，而且原癌基因c-fos的表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步佐證了內(nèi)臟超敏的原因。因此，該模型可以作為CVH-IBS的動(dòng)物模型用于科學(xué)研究。
　　通過(guò)對(duì)鹽酸小檗堿、黃連提取物和戊己丸的代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)給予鹽酸小檗堿后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低。(2)灌胃黃連提取物后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、Tma

17、x和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低，而巴馬汀的藥代參數(shù)未見(jiàn)顯著差異。(3)給予戊己丸后，小檗堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，T1/2、Cmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Tmax、 Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增加，Tmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的C

18、max和AUC0-t顯著增加，Vd/F顯著降低;芍藥苷在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低。
　　4.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較及其機(jī)制研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥后其5個(gè)代表成分在正常大鼠和PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)戊己丸高劑量單次給藥后，小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、 Tm

19、ax、Cmax和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增加，Vd/F和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Tmax、Cmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的AUC0-t顯著增高，Vd/F和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，Vd/F和Cl/F顯著降低。(2)戊己丸高劑量多次給藥后，

20、小檗堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增加，Tmax、Vd/F和Cl/F顯著降低;巴馬汀在PI-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Tmax、VdF和Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在PI-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax、VgF和Cl/F顯著降低;吳茱萸次堿在PI-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增高，Tmax、T1/2、Vd/F和Cl/F顯著降低;芍藥苷在PI-IBS模型大鼠

21、體內(nèi)的T1/2、 Cmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低。(3)透射電鏡的結(jié)果表明:正常組大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接致密;模型組大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，連接疏松、間隙增寬、密度降低;而戊己丸給藥一周后，結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)較模型組恢復(fù)完整，連接恢復(fù)。(4)免疫組化的結(jié)果表明:對(duì)于緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結(jié)腸中顯著下降。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M的表達(dá)顯著高于給藥

22、前的模型組，而在正常組的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達(dá)低于正常組;對(duì)于MLCK，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結(jié)腸中顯著升高。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M的表達(dá)顯著低于給藥前的模型組，而在正常組的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達(dá)高于正常組;對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、MRP1和MRP2，與正常組相比，在PI-IBS模型組大鼠結(jié)腸中的表達(dá)未

23、見(jiàn)明顯變化。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M和正常組內(nèi)的表達(dá)均顯著高于給藥前相應(yīng)的正常組和模型組，但是多次給藥后的正常組和模型組相比，它們的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。(5)免疫熒光的結(jié)果表明:與正常組相比，模型組內(nèi)的緊密連接表達(dá)下降，MLCK的表達(dá)升高。但是多次給藥后，模型組大鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白的表達(dá)顯著高于給藥前的模型組，而MLCK的表達(dá)顯著低于給藥前的模型組。多次給藥后的正常組，緊密連接蛋白和MLCK的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。而多次給藥后

24、的正常組和模型組相比，緊密連接蛋白在模型組的表達(dá)低于正常組，MLCK的表達(dá)高于正常組。
　　5.戊己丸單次給藥及多次給藥在正常大鼠和CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較及其機(jī)制研究戊己丸高劑量單次給藥及多次給藥后其5個(gè)代表成分在正常大鼠和CVH-IBS大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，與正常組相比:(1)戊己丸高劑量單次給藥后，小檗堿和巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2和AUC0-t顯著增加，Cl/F顯著降低;吳茱萸堿在

25、CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cmax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax、Vd/F和Cl/F無(wú)顯著性差異;吳茱萸次堿在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的各藥代參數(shù)均無(wú)顯著性差異;芍藥苷在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Tmax和AUC0-t顯著增高，Cl/F顯著降低。(2)戊己丸高劑量多次給藥后，小檗堿和巴馬汀在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的T1/2、 Vd/F和Cl/F顯著增加，Cmax和AUC0-t顯著降低;吳茱萸堿在CVH-IBS大鼠體內(nèi)的Cm

26、ax和AUC0-t顯著增高，T1/2、Tmax和Vd/F顯著降低;吳茱萸次堿在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Cmax顯著增高，Tmax顯著降低;芍藥苷在CVH-IBS模型大鼠體內(nèi)的Tmax顯著增高，而T1/2、Cmax、AUC0-t、Vd/F和Cl/F無(wú)顯著性差異。(3)透射電鏡的結(jié)果表明:正常組大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)完整、連接致密;模型組大鼠結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)破壞，連接疏松、間隙增寬、密度降低;而戊己丸給藥一周后，結(jié)腸上皮緊密連接結(jié)

27、構(gòu)較模型組恢復(fù)完整，連接恢復(fù)。(4)免疫組化的結(jié)果表明:對(duì)于緊密連接蛋白Occludin和ZO-1，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結(jié)腸中顯著下降。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M的表達(dá)顯著高于給藥前的模型組，而在正常組的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達(dá)低于正常組;對(duì)于MLCK，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結(jié)腸中顯著升高。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M的表達(dá)顯著低于給藥前的模型組，

28、而在正常組的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，在模型組的表達(dá)高于正常組;對(duì)于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp、MRP1和MRP2，與正常組相比，在CVH-IBS模型組大鼠結(jié)腸中的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。多次給藥后，它們?cè)谀Ｐ徒M和正常組內(nèi)的表達(dá)均顯著高于給藥前相應(yīng)的正常組和模型組。但是多次給藥后的正常組和模型組相比，它們?cè)谀Ｐ徒M的表達(dá)顯著高于正常組。(5)免疫熒光的結(jié)果表明:與正常組相比，模型組內(nèi)的緊密連接表達(dá)下降，MLCK的

29、表達(dá)升高。但是多次給藥后的模型組，緊密連接蛋白的表達(dá)顯著高于給藥前的模型組，而MLCK的表達(dá)顯著低于給藥前的模型組。多次給藥后的正常組，緊密連接蛋白和MLCK的表達(dá)與給藥前的正常組無(wú)明顯差異。而多次給藥后的正常組和模型組相比，緊密連接蛋白在模型組的表達(dá)低于正常組，MLCK的表達(dá)高于正常組。
　　結(jié)論：戊己丸單次給藥及多次給藥后在正常動(dòng)物和腸易激綜合征的病理狀態(tài)下的藥代動(dòng)力學(xué)行為存在明顯差異，其差異的機(jī)制可能與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和緊密連接蛋白