高同型半胱氨酸血癥經(jīng)NF-κB-DNMT1誘導(dǎo)ApoE---鼠MCP-1DNA低甲基化致動(dòng)脈粥樣硬化的研究.pdf

1、目的：高同型半胱氨酸血癥(HHcy)是動(dòng)脈粥樣硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因子,動(dòng)脈粥樣硬化是一種以脂質(zhì)、纖維物質(zhì)和細(xì)胞碎片等聚集在血管壁為特征的復(fù)雜的炎癥性疾病,而趨化因子在其中發(fā)揮重要作用。單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)被認(rèn)為是最重要和最具特征的趨化因子,其在正常動(dòng)脈中不表達(dá),而在動(dòng)脈粥樣硬化損傷處表達(dá)增加。DNA甲基化可以解釋基因、環(huán)境和疾病之間的相互關(guān)系,是動(dòng)脈粥樣硬化的早期診斷標(biāo)志,同時(shí)可以調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)擬在ApoE-/-鼠上

2、,探討HHcy是否通過調(diào)節(jié)血液MCP-1DNA低甲基化,而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生,同時(shí)研究NF-κB/DNMT1在其機(jī)制中的作用。
　　方法：選用SPF級(jí)近交系C57BL/6J背景的5周齡雄性ApoE-/-小鼠為研究對(duì)象,適應(yīng)環(huán)境一周后,將小鼠隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、ApoE-/-對(duì)照組、高蛋氨酸組、葉酸和維生素B12干預(yù)組,飼養(yǎng)14周后處死,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)THP-1單核細(xì)胞,以4×106個(gè)接種于25cm×25cm培養(yǎng)瓶中,

3、加入PMA,使其終濃度為500nmol/L,37℃培養(yǎng)48小時(shí),顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài),證實(shí)THP-1細(xì)胞已分化為巨噬細(xì)胞。棄去舊培養(yǎng)液,更換為含終濃度為50mg/L的ox-LDL和100μmol/LHcy的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí),觀察泡沫細(xì)胞的形成,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為3組:對(duì)照組、泡沫細(xì)胞+100μmol/LHcy組(Con+100Hcy)、泡沫細(xì)胞+100μmol/LHcy+50μmol/LPDTC組(Con+

4、100Hcy+50PDTC)。采用主動(dòng)脈病理切片HE染色,泡沫細(xì)胞油紅O染色,全自動(dòng)生化分析儀檢測血清Hcy含量,巢式降落式甲基化特異性PCR(ntMS-PCR)檢測MCP-1DNA甲基化改變,酶聯(lián)免疫吸附法檢測MCP-1、DNMT1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB的含量,高效液相色譜法檢測血清SAH、SAM含量。
　　結(jié)果：
　　1.Hcy致小鼠血管壁損傷形態(tài)學(xué)變化及血清Hcy含量結(jié)果
　　與空白對(duì)照組比較,高蛋氨酸組小鼠主動(dòng)脈管

5、壁可見大量動(dòng)脈粥樣硬化樣物質(zhì),泡沫細(xì)胞和少量炎癥性細(xì)胞。葉酸和維生素B12干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈管壁病變較高蛋氨酸組有所緩解。高蛋氨酸組小鼠血清Hcy水平顯著增加,葉酸和維生素B12干預(yù)組血清Hcy水平較高蛋氨酸組降低(P<0.05)。由此表示,小鼠HHcy和動(dòng)脈粥樣硬化雙模型建立成功。
　　2.小鼠血清SAM和SAH含量
　　與空白對(duì)照組比較,ApoE-/-對(duì)照組、高蛋氨酸組和干預(yù)組的血清中SAM含量分別增加3、3.6、2.45

6、倍(P<0.05),而尤以高蛋氨酸組血清SAM水平增加明顯。高蛋氨酸組血清SAH含量與空白對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)。
　　3.Hcy致小鼠MCP-1DNA低甲基化
　　與空白對(duì)照組比較,高蛋氨酸組MCP-1DNA發(fā)生明顯低甲基化(P<0.05)。MCP-1DNA低甲基化水平與動(dòng)脈粥樣硬化損傷面積兩者呈正相關(guān)(γ=0.5175,P<0.05)。
　　4.Hcy致血清MCP-1分泌增加
　　與空白對(duì)照組比較

7、,高蛋氨酸組血清MCP-1含量明顯增加(P<0.05)。
　　5.血清NF-κB和DNMT1含量
　　與空白對(duì)照組比較,高蛋氨酸組血清NF-κB含量明顯升高(P<0.05),而葉酸和維生素B12干預(yù)組與高蛋氨酸組比較,血清含量降低約2.9倍(P<0.01)。高蛋氨酸組血清DNMT1含量較空白對(duì)照組降低約20.8％(P<0.01),而葉酸和維生素B12干預(yù)組血清DNMT1含量較高蛋氨酸組輕微升高(P<0.05)。血清NF-κB

8、和DNMT1含量兩者呈負(fù)相關(guān)(γ=0.3394,P<0.05)。
　　6.泡沫細(xì)胞NF-κB和DNMT1含量
　　油紅O染色后顯微鏡下觀察可看到脂滴面積等于或大于細(xì)胞核的面積,呈紅色泡沫樣改變,細(xì)胞核呈藍(lán)色的泡沫細(xì)胞。
　　100μmol/LHcy組NF-κB含量與對(duì)照組比較顯著升高(P<0.01)。添加PDTC干預(yù)后泡沫細(xì)胞NF-κB含量與100μmol/LHcy組比較顯著降低(P<0.01)。而100μmol/LH