表沒食子茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)通過AKT-PI3K和MAPKs信號通路誘導經缺氧再灌注處理的臍靜脈內皮細胞凋亡.pdf

1、研究背景和目的:
　　 表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是茶葉的主要活性成分之一.它具有抗增殖、抗氧化、抗誘變等作用[1]。近些年研究發(fā)現(xiàn)EGCG可促進多種癌細胞系,如前列腺癌細胞[2]、人表皮樣癌A431細胞[3]等細胞的凋亡。最近有人報道EGCG通過抑制表皮生長因子受體(EGFR)依賴的AKT和細胞外信號調控激酶(ERK)信號通路,促進永生子宮頸細胞(ECE16)和腫瘤Hella細胞的凋亡[4]。同時,EGCG在內皮細胞

2、、平滑肌細胞和心肌細胞中也起著重要的作用,如EGCG處理可抑制人內皮細胞的分化[5]；通過增加p53蛋白的穩(wěn)定性和增高NF-κB的活性,促進增殖的平滑肌細胞凋亡[6]；通過抑制STAT1的激活,保護缺氧再灌注誘導的心肌細胞凋亡[7]。但是EGCG在缺氧再灌注誘導內皮細胞凋亡中的作用和分子機理尚未見報道。
　　 本研究采用體外培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs),在EGCG(0、10 pM和100μM)和缺氧再灌注處理細胞0-2

3、4小時后,用WST-1法檢測內皮細胞的增殖；用TUNEL染色觀察EGCG對內皮細胞凋亡的影響；應用蛋白免疫印記(Western blot)檢測細胞凋亡相關蛋白剪切的半胱氨酸水解酶-3(cleavedcaspaspe-3,Asp175);多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP—ribose polymerase,PARP)；B細胞淋巴瘤,白血病因子-2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)；Bcl-2相關X蛋

4、白(Bcl-2 associatedⅩ protein,Bax)；細胞周期相關蛋白,如cyclinD1、p21和p27；絲氨酸,蘇氨酸激酶(AKT)；絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)ERK1/2、絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)p38、c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)；熱休克蛋白27(Heat shock protein27,HSP27)等蛋白的表達水平。此外,用P13K特異性抑制劑wort

5、mannin、JNK特異性抑制劑SP600125和ERK1/2特異性抑制劑U0126預處理HUVECs,再進行缺氧再灌注和EGCG處理,用蛋白免疫印記檢測caspase-3的活性；用TUNEL染色觀察內皮細胞的凋亡程度。
　　 實驗結果:
　　 (一)EGCG可明顯抑制HUVECs增殖,且呈劑量和時間依賴關系。同時下調細胞周期相關蛋白cyclin D1的表達,而上調p21和p27的表達。
　　 (二)EGCG促進

6、缺氧再灌注誘導的HUVECs的凋亡,增高caspaspe-3的活性,降低PARP的活性。
　　 (三)缺氧再灌注處理HUVECs后,EGCG可明顯降低Bcl-2蛋白表達和上調Bax蛋白表達水平,且呈時間依賴關系。
　　 (四)EGCG可抑制AKT及下游蛋白FOXO1/3a和ERK1/2的活性,而激活JNK/c-Jun的信號通路,且呈劑量依賴關系。應用信號通路的特異抑制劑進一步證實EGCG通過AKT、ERK1/2和JNK1