銅綠假單胞菌注射液對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者圍手術(shù)期免疫水平的影響.pdf

1、背景:腫瘤發(fā)生和發(fā)展的免疫學(xué)原因有:①腫瘤細(xì)胞通過(guò)改變自身表面的特異性分子，使機(jī)體的免疫監(jiān)視功能低下，從而逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視;②腫瘤細(xì)胞通過(guò)不表達(dá)MHC1類(lèi)抗原和其他抗原肽，從而下調(diào)T細(xì)胞的激活表位;③腫瘤細(xì)胞自身通過(guò)分泌免疫抑制因子，達(dá)到減弱機(jī)體對(duì)其免疫排斥反應(yīng)。所以，提升機(jī)體的免疫功能不僅是防止腫瘤發(fā)生的重要方法，而且可以延長(zhǎng)腫瘤患者的生存期。
　　自1995年Sckaguchi等首先發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(r

2、egulatory Tcell，Treg)以來(lái)，Treg的研究得到了迅速發(fā)展。研究者發(fā)現(xiàn)腫瘤患者體內(nèi)積聚著一群由腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有負(fù)向調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)的CD4+CD25+Treg，具有免疫抑制效應(yīng)，在維持機(jī)體機(jī)體免疫平衡和抑制自身免疫反應(yīng)中具有重要作用。
　　CD4+CD25+Treg分為天然Treg和適應(yīng)性Treg。天然Treg細(xì)胞主要是指一類(lèi)由胸腺T細(xì)胞發(fā)育而來(lái)，它們?cè)谛叵俚乃栀|(zhì)內(nèi)發(fā)育生長(zhǎng)直至成熟后，隨即轉(zhuǎn)移到外周血中，具

3、備抑制自身免疫應(yīng)答功效的細(xì)胞亞群;適應(yīng)性Treg是指在特定的免疫因子作用下，由抗原刺激成熟T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞亞群。
　　CD4+CD25+Treg細(xì)胞在功能上體現(xiàn)為免疫無(wú)能和免疫抑制兩種特性。免疫無(wú)能性體現(xiàn)在對(duì)于高濃度白細(xì)胞介素2(IL-2)單獨(dú)刺激或/和被經(jīng)T細(xì)胞受體(TCR)刺激都沒(méi)有任何反應(yīng)，而且也不分泌IL-2;免疫抑制性體現(xiàn)在通過(guò)一些介導(dǎo)信號(hào)（如T細(xì)胞受體等）的刺激使其活化，從而抑制相關(guān)T細(xì)胞（如CD4+和CD8

4、+等）的活化和增殖，并且抑制非特異性抗原。
　　CD4+CD25+Treg表達(dá)多種細(xì)胞表面分子，如CD25high[白細(xì)胞介素2(interleukin-2，IL-2)受體的α鏈]、CTLA-4(細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4)、GITR（腫瘤壞死因子受體超家族成員糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體）等。同時(shí)，CD4+CD25+Treg高表達(dá)叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(Foxp3)，所以說(shuō)Foxp3可作為其特征性標(biāo)記。
　　Foxp3

5、是基因家族叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子中的一員，它包含一個(gè)保守的氨基酸序列的螺旋轉(zhuǎn)錄因子、一個(gè)C2H2型的鋅指蛋白基因和一個(gè)亮氨酸拉鏈基因序列。人類(lèi)Foxp3基因位于Xp11.23，包括11個(gè)編碼外顯子、3個(gè)非編碼外顯子和10個(gè)內(nèi)含子，它的表達(dá)場(chǎng)所主要位于細(xì)胞核內(nèi)，此種表達(dá)方式和它依靠核轉(zhuǎn)錄因子的功能一致。Foxp3基因是首要的正向調(diào)節(jié)功能蛋白，它是促進(jìn)CD4+CD25+Treg的細(xì)胞發(fā)育和使其發(fā)揮最佳功效的前提條件。
　　大量研究顯示，

6、在肺癌、食管癌、乳腺癌、胃腸道腫瘤、肝癌和卵巢癌等患者的外周血中或腫瘤局部，均發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞的表達(dá)都明顯增高，提示CD4+CD25+Treg細(xì)胞在腫瘤的免疫反應(yīng)中，發(fā)揮了重要的作用。
　　銅綠假單胞菌注射液(PA-MSHA)是一種通過(guò)基因工程的技術(shù)，以銅綠假單胞菌為載體，制備的表達(dá)甘露糖敏感性菌毛的滅活制劑。研究表明，PA-MSHA可以使腫瘤細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行徑，下降腫瘤細(xì)胞

7、的增殖、侵犯和轉(zhuǎn)移能力，從而啟動(dòng)凋亡流程，使腫瘤細(xì)胞凋亡。多項(xiàng)研究顯示，PA-MSHA具有很強(qiáng)的免疫刺激活性:它可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)等抗原提呈細(xì)胞的成熟，對(duì)刺激分子的表達(dá)和對(duì)腫瘤抗原的加工提呈能力有一定的提高和協(xié)同作用;它還可以促進(jìn)Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化，并刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的產(chǎn)生，使機(jī)體的特異性細(xì)胞免疫功能得到增強(qiáng);而且它能間接促進(jìn)NK細(xì)胞的活化，以及直接誘導(dǎo)NK的活化，達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體的非特異性抗腫

8、瘤免疫的作用。臨床研究顯示PA-MSHA能激活人體的免疫反應(yīng)，提高機(jī)體免疫應(yīng)答水平，重建免疫監(jiān)視功能，起到免疫監(jiān)視、抑制和殺傷癌細(xì)胞的作用。當(dāng)前，PA-MSHA在各種惡性腫瘤的輔助治療中已得到廣泛的應(yīng)用。我們將通過(guò)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者圍手術(shù)期進(jìn)行PA-MSHA干預(yù)治療，動(dòng)態(tài)觀察圍手術(shù)期外周靜脈血中各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)的水平，評(píng)價(jià)PA-MSHA對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者圍手術(shù)期免疫功能的影響及安全性研究。
　　方法:在2013年4月-2013年10

9、月期間，將來(lái)自河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸五科收治的60例非小細(xì)胞肺癌患者（手術(shù)前均通過(guò)纖維支氣管鏡活檢獲得病理證實(shí)，手術(shù)前都沒(méi)有進(jìn)行過(guò)放療或化療），按隨機(jī)排列表法分為銅綠假單胞菌注射液治療組（實(shí)驗(yàn)組，30例）和對(duì)照組（30例），對(duì)兩組患者均實(shí)施規(guī)范化的肺癌根治術(shù)。實(shí)驗(yàn)組患者于手術(shù)結(jié)束前胸腔噴灑PA-MSHA5mL，術(shù)后第1d、3d、5d、7d和9d皮下注射PA-MSHA1次，1ml/次;對(duì)照組患者于手術(shù)結(jié)束前胸腔噴灑生理鹽水5mL，術(shù)后第1

10、d、3d、5d、7d和9d皮下注射生理鹽水1次，1ml/次。選取先入院的10例患者，按隨機(jī)排列表法分成實(shí)驗(yàn)組（5例）和對(duì)照組（5例），進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn):兩組患者均實(shí)施規(guī)范性的肺癌根治術(shù)。實(shí)驗(yàn)組患者于術(shù)中胸腔噴灑5ml銅綠假單胞菌注射液后，分別于術(shù)后第1d、3d、5d、7d、9d、11d清晨皮下注射銅綠假單胞菌注射液1次，1ml/次。對(duì)照組患者于術(shù)中胸腔噴灑5ml生理鹽水后，分別于術(shù)后第1d、3d、5d、7d、9d、11d清晨皮下注射生理鹽水1

11、次，1ml/次。兩組患者分別于手術(shù)前1d至術(shù)后第12d每日清晨，在空腹?fàn)顟B(tài)下用EDTA抗凝管采集外周靜脈血2ml，標(biāo)本在3個(gè)小時(shí)之內(nèi)上流式細(xì)胞儀測(cè)定CD3+、CD4+、NK、CD4+CD25+Treg細(xì)胞和Foxp3細(xì)胞計(jì)數(shù)水平，分析總結(jié)各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)結(jié)果并找出其有明顯變化趨勢(shì)的具體時(shí)間，分別為手術(shù)前1d、術(shù)后第2d、術(shù)后第6d和術(shù)后第10d，這些時(shí)間點(diǎn)即為其他患者的最佳檢測(cè)時(shí)間。兩組剩余患者均于手術(shù)前1d，術(shù)后第2d、6d和10d清晨

12、，在空腹?fàn)顟B(tài)下用EDTA抗凝管，分別采集外周靜脈血2ml，標(biāo)本在3小時(shí)內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者的各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)，包括CD3+、CD4+、NK、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Foxp3水平。最后應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:兩組患者術(shù)后CD3+、CD4+和NK細(xì)胞均呈先下降后升高的趨勢(shì)，說(shuō)明手術(shù)打擊可能導(dǎo)致患者免疫功能下降，使術(shù)后CD3+、CD4+和NK細(xì)胞出現(xiàn)暫時(shí)性的下降，隨著患者機(jī)體各系統(tǒng)功能逐

13、漸恢復(fù)，CD3+、CD4+和NK細(xì)胞逐漸升高，但實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第10d的CD3+、CD4+和NK細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，說(shuō)明PA-MSHA對(duì)于機(jī)體的細(xì)胞功能有正向調(diào)控作用。腫瘤切除后，兩組患者CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目均下降，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2d、6d、10d的CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目均較術(shù)前顯著降低(P＜0.05)，對(duì)照組僅術(shù)后第10d的CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目較術(shù)前顯著降低(P

14、＜0.05)，提示腫瘤患者術(shù)前CD4+CD25+Treg和Foxp3計(jì)數(shù)較高，瘤體切除后，CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目逐漸降低，表明CD4+CD25+Treg和Foxp3在非小細(xì)胞肺癌中具有重要作用，手術(shù)治療可以明顯減少Treg的數(shù)量并減弱其免疫抑制功能，機(jī)體的免疫功能得到有效地改善;實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第10d的CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，說(shuō)明PA-MSHA對(duì)于NSCLC患者術(shù)后的CD

15、4+CD25+Treg和Foxp3具有負(fù)向調(diào)控作用，促進(jìn)了機(jī)體免疫功能的重建，更加有利于增強(qiáng)患者術(shù)后的免疫功能。
　　結(jié)論:NSCLC患者術(shù)前免疫狀態(tài)低下，手術(shù)打擊使患者的免疫功能出現(xiàn)暫實(shí)性的下降，在機(jī)體各個(gè)系統(tǒng)的功能逐漸恢復(fù)后，機(jī)體的免疫狀態(tài)也不斷地增強(qiáng)。銅綠假單胞菌注射液干預(yù)治療的NSCLC患者術(shù)后CD4+CD25+Treg和Foxp3數(shù)目明顯低于術(shù)前水平;CD4+CD25+Treg和Foxp3細(xì)胞水平與機(jī)體的免疫功能呈負(fù)相關(guān)