沉默淋巴細(xì)胞cbl-b基因?qū)κ笄傲邢侔㏑M-1細(xì)胞體外殺傷作用的影響.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文沉默淋巴細(xì)胞cbl-b基因?qū)κ笄傲邢侔㏑M-1細(xì)胞體外殺傷作用的影響姓名：溫曉飛申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：外科學(xué)（泌尿外科）指導(dǎo)教師：孫穎浩20100501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文含c b l - b 特異性s i R N A 的慢病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞。將培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞分為三組，對(duì)照組為未經(jīng)處理的C 5 7 小鼠脾臟分離淋巴細(xì)胞，空轉(zhuǎn)組為轉(zhuǎn)染空載體病毒的淋巴細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染c b l - b 特異性s i R

2、N A 慢病毒載體的淋巴細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞表面活化分子C D 6 9 。通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測I L ．2 和I N F ．Y 的分泌。通過C C K 8 法檢測淋巴細(xì)胞增殖情況。3 、小鼠前列腺癌I 洲．1 細(xì)胞，培養(yǎng)于不含雄激素的1 0 ％小牛血清I M D M 培養(yǎng)液中。選取生長良好的R M ．1 細(xì)胞，分別加入未經(jīng)處理的淋巴細(xì)胞、轉(zhuǎn)染c b l - b 特異性s i R N A 慢病毒載體的淋巴細(xì)胞，混合培養(yǎng)。以R

3、 M ．1 鼠前列腺癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞，進(jìn)行C C K 8 實(shí)驗(yàn)檢測各組淋巴細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞殺傷活性。按同樣分組，分別加入T G F ．1 3 抑制后，進(jìn)行C C K 8 實(shí)驗(yàn)檢測淋巴細(xì)胞殺傷活性變化。結(jié)果1 、本研究針對(duì)c b l - b 基因序列設(shè)計(jì)了4 個(gè)不同位點(diǎn)的c b l ．b 特異性s i R N A 序列，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒，通過熒光顯微鏡觀察可見9 0 ％細(xì)胞呈現(xiàn)熒光，提示目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞。W e g e mb l

4、 o t 結(jié)果顯示，2 號(hào)靶點(diǎn)的c b l - b 特異性s i R N A 對(duì)c b l - b基因的敲減作用最為顯著，C b l ．b 蛋白表達(dá)抑制率達(dá)到9 3 ．4 ％，因而是最佳靶點(diǎn)。逐孔稀釋法檢測病毒滴度，結(jié)果顯示獲取病毒滴度約為2 E + 7 T U ／m L ，可用于下一步實(shí)驗(yàn)沉默c b l - b 基因表達(dá)研究。R T - P C R 檢測結(jié)果顯示慢病毒載體滴度值> 2 ．0 0 E + 7T U ／m l ，與逐

5、孔稀釋法檢測病毒滴度相符，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 、以C 5 7 小鼠脾臟成功獲取單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)第七天增殖最強(qiáng)，呈集群生長，易攪拌成單個(gè)游離細(xì)胞。慢病毒載體轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)9 2 ％，W e s t e r n b l o t結(jié)果顯示淋巴細(xì)胞C b l ．b 蛋白抑制率達(dá)8 9 ．4 ％。流式細(xì)胞儀檢測淋巴細(xì)胞表面活化標(biāo)志C D 6 9 ，在轉(zhuǎn)染c b l - - b 特異性s i R N A 慢病毒的淋巴細(xì)胞明顯高于對(duì)照組(

6、 P < 0 ．0 1 ) 。E L I S A 檢測細(xì)胞因子I L ．2 和I N F ．Y 的分泌，轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞明顯高于對(duì)照組( P < O ．0 5 ) 。3 、應(yīng)用C C K 8 試劑盒測定各組淋巴細(xì)胞對(duì)R M ．1 前列腺癌細(xì)胞的體外殺傷作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染c b l - b 特異性s i R N A 后淋巴細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞在比率為4 0 ：1 時(shí)，具有最強(qiáng)的殺傷活性( 殺傷率為4 0 ．9 8 ％) ，比對(duì)照顯

7、著增強(qiáng)( P < O ．0 5 ) 。加入T G F ．B 后，轉(zhuǎn)染c b l ．b 特異性s i R N A 的淋巴細(xì)胞對(duì)R M ．1 細(xì)胞的殺傷活性無明顯抑制。結(jié)論l 、本研究構(gòu)建的c b A b 特異性s i R N A 重組表達(dá)質(zhì)粒慢病毒載體，能夠有效抑制淋巴細(xì)胞c b l ．b 基因表達(dá)，達(dá)到c 6 m 基因沉默的目的。2 、c b b b 特異性s i R N A 轉(zhuǎn)染的淋巴細(xì)胞其細(xì)胞活化明顯增強(qiáng)，細(xì)胞因子l L ．2