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文檔簡(jiǎn)介
1、背景:
高脂血癥是一種危害性大的疾病,黃連是常用的重要降脂中藥,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)黃連的降脂作用與上調(diào)肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化成膽酸的關(guān)鍵限速酶—膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)有關(guān),但具體機(jī)制未明。
目的:
通過(guò)研究,明確LXRα和PPARα在降脂中藥黃連調(diào)控CYP7A1的作用,并闡明黃連調(diào)節(jié)CYP7A1的物質(zhì)基礎(chǔ)。
方法:
體內(nèi)研究:健康雄性SD大鼠,體重在180-200g之間,用高脂飼料喂食
2、建立高脂模型,鼠尾取血檢測(cè)血清生化指標(biāo):總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。動(dòng)物分為:正常組,模型組,中藥復(fù)方活性成分——黃連生物堿提取物(Coptidis alkaloids extract,CAE)低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組,辛伐他汀(10 mg/kg)組。每組10只,其中正常組給予普通飼料,其他組給予高脂飼料,
3、給藥組每天給予不同劑量 CAE或辛伐他汀,飼養(yǎng)給藥4周,實(shí)驗(yàn)結(jié)束前3天收集糞便樣品,實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天麻醉大鼠,經(jīng)眼眶取血或剖腹、腹主動(dòng)脈采血,砍頭處死大鼠,收集肝組織樣品,檢測(cè)大鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C的含量,檢測(cè)肝臟和糞便中的膽固醇、總膽汁酸含量,以及大鼠肝臟微粒體CYP7A1酶活性;提取大鼠肝臟的總RNA,reversr transcription PCR(RT-PCR)檢測(cè)目的基因的表達(dá)變化。
體外研究:(1
4、)小檗堿(Berberine,BBR)對(duì)大鼠BRL-3A細(xì)胞中CYP7A1、LXRα、PPARα的基因和蛋白表達(dá)的影響:培養(yǎng)大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A,MTT法確定給藥安全濃度范圍,設(shè)置對(duì)照組、BBR低(0.3μM)、中(3μM)、高(10μM)劑量組,培養(yǎng)12/24小時(shí),提取細(xì)胞樣品的總RNA和蛋白,采用RT-PCR和western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞樣品中CYP7A1、LXRα、PPARα的基因和蛋白表達(dá)變化;(2)基因阻斷實(shí)驗(yàn):
5、培養(yǎng)BRL-3A細(xì)胞,給予BBR同時(shí)添加LXRα或PPARα的基因阻斷藥物(GGPP/MK-886),抑制上游調(diào)控因子LXRα或PPARα的表達(dá),培養(yǎng)24小時(shí)后提取細(xì)胞的總RNA和蛋白,觀察CYP7A1的基因、蛋白表達(dá)的變化;(3)高膽固醇誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)BRL-3A細(xì)胞,設(shè)置空白對(duì)照組、高膽固醇組(5μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量 BBR組(0.3μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量 BBR組(10μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量
6、BBR(0.3μM)+GGPP組(10μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量BBR(10μM)+GGPP組(10μM)、高膽固醇(5μM)+低劑量BBR(0.3μM)+MK-886組(10μM)、高膽固醇(5μM)+高劑量BBR(10μM)+MK-886組(10μM),培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)后,提取RNA,RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA表達(dá)變化,觀察BBR對(duì)高膽固醇刺激下的細(xì)胞CYP7A1、LXRα、PPARα的基因調(diào)控。
結(jié)果:
7、 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明:與模型組比較,CAE能夠顯著降低大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平(P<0.05或P<0.01),還能促進(jìn)大鼠肝CYP7A1、LXRα和PPARαmRNA的表達(dá),具有劑量依賴性,實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)有顯著性差異(P<0.05或 P<0.01);并且 CAE能提高大鼠肝臟CYP7A1酶活性,在肝臟中減少膽固醇、增加膽汁酸含量,促進(jìn)糞便中膽固醇和膽汁酸的排泄(P<0.05或P<0.01)。
體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1) B
8、BR(給藥后24小時(shí))能促進(jìn)BRL-3A細(xì)胞CYP7A1 mRNA和蛋白的表達(dá),且在給藥后早時(shí)段(12小時(shí))時(shí)就已經(jīng)促進(jìn)LXRα和PPARα mRNA和蛋白的表達(dá),實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)有顯著性差異(P<0.05或P<0.01);(2)添加了LXRα或、PPARα的基因阻斷藥物(GGPP/MK-886),再給予BBR后CYP7A1的基因、蛋白表達(dá)均被抑制,實(shí)驗(yàn)組間數(shù)據(jù)具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01);(3) BRL-3A細(xì)胞在高劑量的
9、膽固醇刺激下,CYP7A1 mRNA表達(dá)升高,而LXRα和PPARαmRNA則有所降低;同時(shí)加入BBR后,CYP7A1 mRNA表達(dá)量升高更為顯著(P<0.05或P<0.01)且具有劑量依賴性,BBR對(duì)LXRα mRNA的促進(jìn)作用在低劑量時(shí)達(dá)到最強(qiáng),而PPARαmRNA的表達(dá)則與CYP7A1相似。阻斷LXRα/PPARα基因表達(dá)后,CYP7A1 mRNA的表達(dá)均受到抑制(P<0.05或P<0.01)。
結(jié)論:
降脂中
10、藥黃連活性組分對(duì)飲食性高脂血癥大鼠有良好的降膽固醇治療作用,其可能的作用機(jī)制包括:
(1)增強(qiáng)肝臟CYP7A1 mRNA表達(dá),提高CYP7A1酶活性,促進(jìn)肝臟中膽固醇向膽汁酸轉(zhuǎn)化,以及膽固醇在機(jī)體的轉(zhuǎn)化排泄,從而降低體內(nèi)膽固醇水平,改善高膽固醇血癥、高脂血癥的癥狀。CAE是中藥降脂方FTZ降膽固醇的主要活性組分;
(2)CAE的主要活性成分 BBR,通過(guò)促進(jìn) CYP7A1上游調(diào)控因子 LXRα/PPARαmRNA的表
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