苦瓜蛋白降脂活性成分純化及功效評價(jià).pdf

1、苦瓜是葫蘆科苦瓜屬植物苦瓜(Momordica charantia L, MC)的果實(shí),原產(chǎn)于印度東部?，F(xiàn)代研究證明苦瓜具有降血脂、降血糖、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效。本論文以新鮮苦瓜為原料,對苦瓜粗提物的降血脂活性進(jìn)行了研究,并通過脂肪肝細(xì)胞模型從中篩選出降血脂活性肽MCP3-2,同時(shí)對苦瓜多肽的降脂機(jī)理進(jìn)行了研究。
　　第一部分,緒論。概述了苦瓜的藥理作用及其活性成分;介紹了高脂血癥的危害及治療措施,以及生物活性肽的研究進(jìn)

2、展;綜述了苦瓜降血脂作用的研究方法及意義。
　　第二部分,苦瓜粗提物對SD大鼠的降血脂作用。通過喂食特殊加工的高脂飼料8周后建立高脂血癥大鼠模型,建模成功后給予不同劑量(50、100和200mg/kg)的苦瓜粗提物和辛伐他汀(10mg/kg)。灌胃4周后,檢測血脂和肝脂指標(biāo),計(jì)算臟器指數(shù),并進(jìn)行肝臟病理學(xué)觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同劑量(50、100和200mg/kg)的苦瓜粗提物和辛伐他汀均可顯著降低高脂血癥大鼠的血脂濃度和肝脂濃度

3、,另外對大鼠體重和臟器質(zhì)量沒有影響,但是可顯著降低腎周脂肪質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)中最佳有效劑量為100mg/kg,該劑量苦瓜粗提物可顯著提高了HDL-C的濃度,同時(shí)降低LDL-C的濃度,降低動(dòng)脈粥樣指數(shù),表明中劑量苦瓜粗提物具有一定抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。此外,苦瓜粗提物顯著降低肝臟中ALT、AST和FFA濃度,對肝臟有保護(hù)功能。肝臟病理切片顯示,苦瓜粗提物顯著減少了肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪空泡的數(shù)量,對脂肪肝有一定的治療作用。以上結(jié)果表明苦瓜粗提物各劑量組

4、均能顯著降低血清和肝臟中TG濃度,修復(fù)肝組織結(jié)構(gòu)形態(tài)及功能,具有顯著的利肝清脂的功效。
　　第三部分苦瓜多肽的分離純化。本部分運(yùn)用硫酸銨沉淀蛋白法和透析技術(shù)對苦瓜進(jìn)行初步分離得到苦瓜粗提物(MCE),用Sephadex G-75凝膠層析柱對苦瓜粗提物進(jìn)行初步分離得到3個(gè)級分:MCP-1、 MCP-2和 MCP-3。并結(jié)合體外降血脂實(shí)驗(yàn),篩選出具有降血脂活性成分 MCP-3,利用 Sephadex G-25凝膠層析柱對MCP-3進(jìn)行

5、純化得到3個(gè)級分,并篩選出具有降血脂活性成分MCP3-2和MCP3-3。利用分析技術(shù)確定了苦瓜粗提物及其級分的化學(xué)成分。結(jié)果表明,苦瓜的化學(xué)組成為:水分93.5％,灰分1.92%,粗蛋白1.93%,粗脂肪0.89%,多糖1.71%。經(jīng)過純化后,各個(gè)級分的蛋白質(zhì)(多肽)含量都達(dá)到95%以上。并對級分進(jìn)行氨基酸組成分析。結(jié)果表明:苦瓜粗提物中含量最高的氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,三者約占氨基酸總含量的33.66%。MCP-1中含量最高

6、的氨基酸為賴氨酸、谷氨酸和天門冬氨酸,三者約占氨基酸總含量的31.68%。MCP-2中含量最高的氨基酸為谷氨酸、天冬氨酸和丙氨酸,三者約占苦瓜粗提物氨基酸總含量的32.64%。MCP-3中含量最高的是谷氨酸、天冬氨酸和亮氨酸,三者約占氨基酸總含量的39.65%。MCP3-1中含量最高的是谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸,三者約占氨基酸總含量的26.13%。MCP3-2中含量最高的是天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸,三者約占氨基酸總含量的37.51%。MC

7、P3-3中含量最高的是谷氨酸、絲氨酸和賴氨酸,三者約占氨基酸總含量的33.58%。結(jié)合體外降血脂活性實(shí)驗(yàn),與其他非活性成分相比, MCP3-2和MCP3-3中絲氨酸和賴氨酸含量較高,這可能與其降血脂活性有關(guān)。
　　第四部分苦瓜多肽對 HepG2細(xì)胞甘油三酯代謝的影響及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)將MCP3-2、MCP3-3兩個(gè)級分進(jìn)行體外降血脂實(shí)驗(yàn)。本部分建立了游離脂肪酸(棕櫚酸:油酸,2:1,FFA)孵育HepG2細(xì)胞建立非酒精性脂肪肝模型,建

8、模成功后分別給予MCP3-2和MCP3-3各個(gè)劑量(10、25、50和100μg/mL)。孵育48h后檢測細(xì)胞內(nèi)TG含量和CPT1A酶活性,并利用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,治療組在治療后,在甘油三酯指標(biāo)上與模型組相比具有顯著性差異(P<0.01),分別下降43.8%、47.5%。CPT1A酶活性與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05)。預(yù)防在治療后,在甘油三酯指標(biāo)上與模型組相比具有顯著性差異(P<0.01),分別