圓錐動(dòng)脈干畸形患兒TGFβ2基因序列分析及表達(dá)水平的研究.pdf

1、先天性心臟?。ê?jiǎn)稱先心病）是我國兒童最常見的出生缺陷病之一，全球發(fā)病率約為9/1000，在我國已成為先天畸形的首位病種。圓錐動(dòng)脈干畸形是一類由于流出道發(fā)育異常導(dǎo)致的先天性心血管畸形，占全部先心病的30％，包括法洛四聯(lián)癥、右室雙出口、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、永存動(dòng)脈干、肺動(dòng)脈閉鎖等，可以導(dǎo)致新生兒時(shí)期出現(xiàn)低氧血癥和難以糾正的酸中毒，自然預(yù)后不佳。部分患兒經(jīng)過外科手術(shù)糾治后仍將存在一系列殘余問題，從而影響患兒的生活質(zhì)量，并且給社會(huì)和家庭帶來較大的經(jīng)濟(jì)和

2、精神負(fù)擔(dān)。
　　目前，普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為先心病是內(nèi)在遺傳易感因素和外界環(huán)境致畸因素共同作用的結(jié)果。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，包括TGFβ2在內(nèi)的遺傳易感基因成為研究熱點(diǎn)。TGFβ2是高度保守TGFβ超家族成員之一，具有多種生物學(xué)作用?；蚯贸男∈髸?huì)導(dǎo)致心臟出現(xiàn)包括右室雙流出道、房室管畸形等多種圓錐動(dòng)脈干畸形，在維甲酸處理的小鼠胚胎中，內(nèi)源性TGFβ2表達(dá)降低，小鼠心臟出現(xiàn)流出道隔發(fā)育異常。Kubalak等研究發(fā)現(xiàn)，RXRA敲除小鼠中

3、TGFβ2表達(dá)升高，使得細(xì)胞凋亡增加，從而導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)流出道發(fā)育的異常。推測(cè)TGFβ2基因很可能是圓錐動(dòng)脈干畸形的致病易感基因。然而，盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGFβ2基因與心臟的畸形發(fā)育有密切的相關(guān)性，但是人類圓錐動(dòng)脈干畸形與TGFβ2基因的相關(guān)研究還非常有限。
　　本課題擬研究TGFβ2基因在圓錐動(dòng)脈干畸形患兒中的基因型，探尋可能導(dǎo)致圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)生的突變或者單核苷酸多態(tài)性，以及分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平探究TGFβ2基因在圓錐動(dòng)脈干

4、畸形患兒流出道組織中的表達(dá)水平，并且與正常流出道組織中TGFβ2基因表達(dá)水平相比較，探討TGFβ2基因與人類圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)生的關(guān)系，為進(jìn)一步深入研究圓錐動(dòng)脈干畸形的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和立論基礎(chǔ)。
　　第一部分圓錐動(dòng)脈干畸形患兒TGFβ2基因編碼區(qū)DNA序列分析
　　目的:
　　通過對(duì)圓錐動(dòng)脈干畸形患兒TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列的檢測(cè)，探尋可能存在的導(dǎo)致疾病發(fā)生的基因變異，明確TGFβ2基因是否為圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)

5、生的遺傳易感基因及其變異位點(diǎn)。
　　方法:
　　應(yīng)用PCR技術(shù)以及測(cè)序方法，選取400例確診為圓錐動(dòng)脈干畸形的患兒的外周血，檢測(cè)TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列，分析編碼區(qū)序列的改變并探尋這些改變與圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)生的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　入選的400例圓錐動(dòng)脈干畸形病人診斷分類包括法洛四聯(lián)癥、左室雙流出道、右室雙出口、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位和肺動(dòng)脈閉鎖。對(duì)TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列檢測(cè)，400例圓錐動(dòng)脈干畸形患兒血樣中

6、有一例存在一個(gè)雜合變異c.597T＞C，此種變異位于第四外顯子，但是沒有引起所編碼氨基酸的改變，仍然為異亮氨酸，我們?cè)赨CSC數(shù)據(jù)庫中并未查到此種變異，認(rèn)為其為新發(fā)現(xiàn)的同義突變。
　　小結(jié):
　　在400例圓錐動(dòng)脈干畸形患兒TGFβ2基因外顯子編碼區(qū)序列檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)1例患兒存在一個(gè)同義突變，即c.597T＞C，編碼的氨基酸仍然為異亮氨酸。因此認(rèn)為， TGFβ2基因編碼區(qū)突變不是出生后兒童圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)生的常見原因。

7、　　第二部分圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心臟流出道組織TGFβ2基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)
　　目的:
　　觀察TGFβ2基因mRNA在圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心臟流出道組織的表達(dá)水平，并比較與正常兒童表達(dá)量的差異，探討TGFβ2基因表達(dá)水平對(duì)人類心臟發(fā)育的影響。同時(shí)檢測(cè)正常胎兒心臟組織TGFβ2基因的表達(dá)水平，探尋TGFβ2基因在人類心臟發(fā)育過程中的表達(dá)特點(diǎn)。
　　方法:
　　選取圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心肌流出道組織57例作為病例組

8、，由5例正常兒童流出道心肌組織和13例成人流出道心肌組織作為對(duì)照組;20例胎兒正常心臟組織應(yīng)用于研究TGFβ2基因在人類心臟發(fā)育過程中的時(shí)序表達(dá)特點(diǎn)。所有組織經(jīng)過RNA提取，應(yīng)用real-time PCR檢測(cè)TGFβ2基因在人類心臟中的表達(dá)水平，運(yùn)用Mann-Whitney檢驗(yàn)，認(rèn)為P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.TGFβ2基因mRNA表達(dá)在圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心肌組織中與正常對(duì)照中比較，其表達(dá)差異無統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義。
　　2.TGFβ2基因mRNA在胎兒正常心臟組織中表達(dá)量明顯高于出生之后的圓錐動(dòng)脈干畸形患兒和正常對(duì)照。
　　3.TGFβ2基因mRNA在胎兒正常心臟中的表達(dá)水平，呈現(xiàn)出隨著胎齡的逐漸增大，表達(dá)水平逐漸降低的負(fù)相關(guān)趨勢(shì)。
　　小結(jié):
　　1.TGFβ2基因mRNA表達(dá)水平在病例組和對(duì)照組中并無明顯差異。由于TG邛超家族成員具有相似的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)方式和生物學(xué)作用模式，各亞型之間可發(fā)揮一定補(bǔ)償作用，提示

10、TGFβ2基因?qū)A錐動(dòng)脈干畸形的產(chǎn)生機(jī)制并不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)。本部分結(jié)果不能證明TGFβ2與人類CTD的發(fā)生具有明顯的關(guān)系。
　　2.明確TGFβ2在人類心臟發(fā)育過程中呈現(xiàn)一種時(shí)序性表達(dá)方式:TGFβ2基因表達(dá)在胚胎發(fā)育中明顯高于出生之后，且表達(dá)量與胎齡呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，出生后的表達(dá)量維持在一定水平。
　　第三部分圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心臟流出道組織TGFβ2基因蛋白表達(dá)水平檢測(cè)
　　目的:
　　觀察TGFβ2基因蛋白在

11、圓錐動(dòng)脈干畸形患兒心臟流出道組織的表達(dá)水平，并比較與正常兒童表達(dá)量的差異，探討TGFβ2蛋白表達(dá)水平在圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)生過程的作用機(jī)制。
　　方法:
　　選取12例圓錐動(dòng)脈干畸形患兒和3例正常兒童心肌流出道組織作為研究對(duì)象，運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)TGFβ2基因蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果:
　　本研究顯示，在人類心肌組織中，TGFβ2基因蛋白質(zhì)的表達(dá)水平在病例組與正常對(duì)照組中無明顯差異。
　　小結(jié):