法洛四聯(lián)癥患兒VANGL2、TGFβ2、PAX3基因的序列、甲基化及表達(dá)研究.pdf

1、圓錐動(dòng)脈干畸形是一類(lèi)復(fù)雜型先心病，可以導(dǎo)致新生兒時(shí)期出現(xiàn)低氧血癥和難以糾正的酸中毒，引起患兒早期死亡。先心病是多基因與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳因素日益受到重視。VANGL2、TGFβ2和PAX3基因敲除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)了圓錐動(dòng)脈干畸形的表現(xiàn)，因而被認(rèn)為是圓錐動(dòng)脈干畸形發(fā)病的候選基因。然而，在人類(lèi)圓錐動(dòng)脈干畸形與VANGL2、TGFβ2和PAX3基因的研究還非常有限。本課題擬研究法洛四聯(lián)癥患兒的VANGL2、FGFβ2和PAX3等三個(gè)基

2、因的外顯子區(qū)及5’非編碼區(qū)(5’-UTR區(qū))的基因序列、甲基化水平以及其在右室流出道心肌組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，探討VANGL2、TGFβ2和PAX3基因與法洛四聯(lián)癥的關(guān)系，為深入研究以法洛四聯(lián)癥為代表的圓錐動(dòng)脈干畸形的發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)和基礎(chǔ)。
　　 第一部分法洛四聯(lián)癥患兒VANGL2、TGFβ2、PAX3基因序列研究
　　 目的：
　　 探討法洛四聯(lián)癥患兒VANGL2、TGFβ2、PAX3基因的序列變化

3、，觀察這些基因是否為法洛四聯(lián)癥發(fā)病的候選易感基因。
　　 方法：
　　 應(yīng)用PCR技術(shù)以及測(cè)序方法，對(duì)100例法洛四聯(lián)癥患兒、200例心臟結(jié)構(gòu)正常的健康兒童，對(duì)VANGL2、TGFβ2和PAX3基因編碼區(qū)外顯子和其上游5’-非編碼區(qū)前1500bp左右的堿基序列進(jìn)行測(cè)序。對(duì)VANGL2、TGFβ2和PAX3基因序列變化與圓錐動(dòng)脈干畸形的關(guān)系進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、VANGL2基因序列分析

4、　　 檢測(cè)VANGL2基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)3種多態(tài)類(lèi)型，其中第7外顯子的33543位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)等位基因A、G改變，在第8外顯子34641位點(diǎn)等位基因G、A改變位于基因編碼區(qū)內(nèi)，未造成編碼氨基酸的改變，且在病例組和對(duì)照組間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5’-UTR區(qū)的9010位點(diǎn)存在T、G等位基因改變，在兩組間基因型差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=6.865，P=0.032)，認(rèn)為5’-UTR區(qū)9

5、010位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性改變可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)。
　　 2、TGFβ2基因序列分析
　　 檢測(cè)TGFβ2基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列，在編碼區(qū)全部8個(gè)外顯子區(qū)未發(fā)現(xiàn)基因序列改變，在5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中9126位點(diǎn)等位基因A、C改變和9353位點(diǎn)等位基因A、G改變?cè)诓±M和對(duì)照組中無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而9040_9043位點(diǎn)在部分病例組合對(duì)照

6、組中出現(xiàn)CTTC片段缺失，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=17.469，P<0.001)，考慮5’-UTR區(qū)90409043位點(diǎn)的多態(tài)性改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)，推測(cè)CTTC片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素(OR=3.692，95％CI：1.971-6.917)。
　　 3.PAX3基因序列分析
　　 檢測(cè)PAX3基因的全部編碼區(qū)外顯子序列和第一外顯子上游1500bp的5’-UTR區(qū)域序列，在編碼區(qū)第2外顯

7、子的95457位點(diǎn)上所有的病例組和對(duì)照組均表現(xiàn)為GG純合子改變，考慮為中國(guó)人群的正常堿基序列。在5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)病例組有2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中97596位點(diǎn)表現(xiàn)為G、C等位基因單核苷酸多態(tài)性改變，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=4.367，P=0.037)，推測(cè)該位點(diǎn)多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)；在9763297655位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)兩組均有部分樣本出現(xiàn)12個(gè)GT重復(fù)片段缺失改變，且兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(X2=72.0，P<0

8、.001)，推測(cè)5’-UTR區(qū)9763297655位點(diǎn)多態(tài)性改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)，且12個(gè)GT重復(fù)片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素(OR=16，95％CI：8.002-31.994)。
　　 在PAX3基因5’-UTR區(qū)域發(fā)現(xiàn)2個(gè)突變位點(diǎn)，其中在100例病例組中，有5例法洛四聯(lián)癥患兒表現(xiàn)有9765497655位點(diǎn)的一個(gè)GT片段缺失改變，1例法洛四聯(lián)癥患兒98064位點(diǎn)出現(xiàn)G>GA的改變，認(rèn)為是中國(guó)人群中法洛四聯(lián)癥

9、患兒的突變位點(diǎn)。
　　 小結(jié)：
　　 1、VANGL2基因5’-UTR區(qū)9010位點(diǎn)T/G單核苷酸的多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)。
　　 2、TGFβ2基因5’-UTR區(qū)域90409043位點(diǎn)CTTC片段缺失改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)，推測(cè)CTTC片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素。
　　 3、PAX3基因5’-UTR區(qū)域97596位點(diǎn)G/C單核苷酸多態(tài)性可能與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)

10、，9763297655位點(diǎn)12個(gè)GT重復(fù)片段缺失改變與法洛四聯(lián)癥的遺傳易感性有關(guān)，該位點(diǎn)12個(gè)GT片段的表達(dá)可能是法洛四聯(lián)癥的危險(xiǎn)因素。
　　 4、PAX3基因5’-UTR區(qū)域9765497655位點(diǎn)的單個(gè)GT片段缺失和5’-UTR區(qū)域98064位點(diǎn)G>GA的改變是中國(guó)人群中法洛四聯(lián)癥患兒的突變位點(diǎn)。
　　 第二部分 VANGL2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化及表達(dá)差異的初步研究
　　

11、 目的：
　　 觀察VANGL，2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化及表達(dá)差異，探討這些基因在法洛四聯(lián)癥發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法：
　　 選取5例法洛四聯(lián)癥患兒右室流出道心肌組織作為研究對(duì)象，通過(guò)MBD柱層析與甲基化敏感性限制性?xún)?nèi)切酶聯(lián)用法(COMPARE-MS)觀察VANGL2，TGFβ2，PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中甲基化水平變化；應(yīng)用real-timePCR和免疫組化

12、的方法檢測(cè)VANGL2、TGFβ2、PAX3基因在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織VANGL2、TGFβ2和PAX3基因5’-UTR區(qū)甲基化水平較對(duì)照組均降低。
　　 2、TGFβ2、PAX3基因mRNA在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中表達(dá)明顯高于對(duì)照組。VANGL2基因mRNA在在法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中表達(dá)明顯低于對(duì)照組。
　　 3、PAX3蛋白表達(dá)水平在

13、法洛四聯(lián)癥患兒心肌組織中明顯高于對(duì)照組。TGFβ2蛋白在心肌細(xì)胞中表達(dá)水平在病例組和對(duì)照組間差異不明顯，但在病例組可見(jiàn)心肌細(xì)胞周?chē)拈g質(zhì)組織中有TGFβ2蛋白的表達(dá)。VANGL2蛋白在病例組心肌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。
　　 小結(jié)：
　　 1、PAX3和TGFβ2基因的表達(dá)升高可能與法洛四聯(lián)癥的發(fā)生有關(guān)。PAX3和TGFβ2基因甲基化水平降低可能與其表達(dá)水平升高有關(guān)。
　　 2、VANGL2基因在心肌組織中