法洛四聯(lián)癥患者心肌組織基因甲基化變異及機(jī)制研究.pdf

1、先天性心臟病(congenital heart disease)，簡(jiǎn)稱(chēng)先心病，是指胚胎發(fā)育過(guò)程中心臟和血管結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的一類(lèi)疾病。近年來(lái)出生缺陷調(diào)查資料顯示，先心病已躍居我國(guó)出生缺陷畸形首位，發(fā)病率占新生活產(chǎn)嬰兒的6‰～10‰。圓錐動(dòng)脈干畸形(conotruncaldefects，CTD)是先心病中最為嚴(yán)重的一種類(lèi)型，約占先心病的15～20％，臨床上表現(xiàn)為法洛四聯(lián)癥、肺動(dòng)脈閉鎖、大動(dòng)脈轉(zhuǎn)位、右室雙出口、永存動(dòng)脈干等多種復(fù)雜心血管畸形，是

2、造成我國(guó)嬰兒和新生兒死亡最主要的原因之一。法洛四聯(lián)癥(tetralogy of Fallot，TOF)是圓錐動(dòng)脈干畸形中最常見(jiàn)的類(lèi)型，約占整個(gè)先心病的10％，它具有四個(gè)明顯的特征：室間隔缺損、主動(dòng)脈騎跨、肺動(dòng)脈狹窄和右心室肥厚。盡管目前的手術(shù)矯正效果良好，仍然有大約0.5％到6％的疾病患者在術(shù)后死于各種并發(fā)癥等，確切病因尚不明確。研究證實(shí)，環(huán)境因素和遺傳因素均可能參與先心病的發(fā)生。環(huán)境因素對(duì)疾病發(fā)生的影響，主要表現(xiàn)在表觀遺傳學(xué)層面。但到

3、目前為止，表觀遺傳學(xué)與先心病的關(guān)系鮮有報(bào)道。
　　 本課題以法洛四聯(lián)癥患者右室流出道梗阻組織樣本為研究對(duì)象，以法醫(yī)尸檢非心源性死亡心臟相應(yīng)部位組織為對(duì)照，研究患者心肌組織DNA甲基化的變化情況，評(píng)估DNA甲基化狀態(tài)與疾病發(fā)生的相關(guān)性，建立法洛四聯(lián)癥DNA甲基化特征譜，探討法洛四聯(lián)癥患者的表觀遺傳學(xué)改變，為該疾病的病因研究和發(fā)病機(jī)制探討提供新的思路和線索。
　　 本課題研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分：
　　 第一部分，對(duì)法洛

4、四聯(lián)癥患者心肌組織整體甲基化水平進(jìn)行研究，檢測(cè)患者基因組整體甲基化狀態(tài)，分析整體甲基化變化與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。LINE-1基因約占人整體基因組的17～25％，該基因的甲基化水平在一定程度上反映了整體基因組甲基化狀態(tài)。本研究通過(guò)MassArray EpiTYPER甲基化分析平臺(tái)研究了LINE-1基因在32例病例組織和15例正常對(duì)照心肌組織中的甲基化水平，通過(guò)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 第二部分，研究法洛四聯(lián)癥患者心臟組織中MB

5、D2(methyl-CpG binding protein2)和三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的表達(dá)，分析這些基因表達(dá)之間的關(guān)系以及對(duì)整體甲基化水平的影響。首先從48例病例心臟組織和16例正常對(duì)照組織中提取總RNA，驗(yàn)證RNA的完整性；其次，以QRT-PCR方法對(duì)MBD2和三種DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶mRNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；最后，通過(guò)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。
　　 第三部分，整理出

6、已報(bào)道的與先心病發(fā)生密切相關(guān)的71個(gè)基因，通過(guò)對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行分析(http：//genome.ucsc.edu/)，設(shè)計(jì)了113個(gè)擴(kuò)增子，這些擴(kuò)增子分布在基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島，CpG島岸和非CpG島的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)(http：//www.epidesigner.com/)。利用MassArray EpiTYPER平臺(tái)對(duì)113個(gè)擴(kuò)增子甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，獲得具有明顯甲基化差異的基因，然后在更大樣本量中對(duì)這些基因的

7、甲基化狀態(tài)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，建立法洛四聯(lián)癥患者心肌組織特異性的甲基化譜；以QRT-PCR方法檢測(cè)有明顯甲基化差異基因的mRNA水平，分析基因的甲基化狀態(tài)對(duì)其mRNA表達(dá)水平的影響。
　　 研究結(jié)果
　　 第一部分：通過(guò)對(duì)LINE-1甲基化狀態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)法洛四聯(lián)癥患者右室流出道梗阻組織整體甲基化水平顯著低于正常對(duì)照組(59.70％vs57.95％，p=0.0021)。該疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨著甲基化程度的降低而顯著增高(OR=1

8、4.7，95％CI：1.8-117.7，P=0.014)。被檢者工作特征曲線分析(ROC)證實(shí)了以基因組總體甲基化水平預(yù)測(cè)TOF的準(zhǔn)確性(AUC=0.78.95％CI：0.65-0.91；p=0.002)。通過(guò)對(duì)年齡和性別與LINE-1甲基化狀態(tài)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)整體基因組甲基化水平與年齡和性別沒(méi)有相關(guān)性。
　　 第二部分：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和MBD2基因的mRNA水平在法洛四聯(lián)癥患者心肌組織中的表達(dá)水平均顯著低于正常對(duì)照組(p<

9、0.001)，尤其是DNMT1和DNMT3B降低最明顯。兩兩相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在正常組中僅有DNMT1與DNMT3A表現(xiàn)出正相關(guān)(r=0.718。p=0.002)，而整體基因組甲基化狀態(tài)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和MBD2基因表達(dá)不相關(guān)；在TOF病例組中，各DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和MBD2基因表達(dá)之間彼此均表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)(p<0.05)，整體基因組甲基化水平與MBD2之間表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)(r=-0.579，p=0.005)。
　　 第三部分

10、：通過(guò)MassArray EpiTYPER技術(shù)平臺(tái)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了10例患者心臟組織和6例正常對(duì)照組織中71個(gè)基因(113個(gè)擴(kuò)增子)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，在113個(gè)擴(kuò)增子中有26個(gè)擴(kuò)增子(涉及到26個(gè)基因)表現(xiàn)出顯著的差異性。其中17個(gè)基因(CFC1B，DFLZ EGFR，EDNRA，EVC2，GJA5，HAND1，HAS2，HSPG2，MED13L，NFATC1，NKX2-5，NFATC2，PAX3，TBX5，TEK，ZFPM2)

11、的甲基化表現(xiàn)為上調(diào)，9個(gè)基因(EDN1，HOXA3，MYH6，NR2F2，NRG1，NRP1，PDGFRA，SLC2A10，TBX20)的甲基化為下調(diào)。這26個(gè)基因中，所檢測(cè)的甲基化區(qū)域位于CpG島的基因包括：DVL2，EDN1，EGFR，EVC2，HAND1，HAS2，HSPG2，NKX2-5，NRG1，NFATC2，PAX3，PDGFRA，SLC2A10，TBX20；位于CpG島岸的基因包括：EDNRA，MED13L，NFATC1，

12、NR2F2，NRP1，TBX5，ZFPM2；位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)區(qū)域(無(wú)CpG島)的基因包括：CFC1B GJA5，HOXA3，MYH6，TEK。綜合考慮上述基因在心臟發(fā)育中的作用，以及其甲基化差異的程度，我們最后明確了11個(gè)候選基因(CFC1B，EGFR，EVC2，GJA5，HAND1，NKX2-5，NR2F2，NFATC2，TBX5，TBX20，ZFPM2)，其中包括9個(gè)甲基化上調(diào)的基因和2個(gè)下調(diào)的基因。通過(guò)擴(kuò)大樣本量(42病例組織和2

13、2例正常對(duì)照組織)，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)實(shí)驗(yàn)相符。同時(shí)，我們檢測(cè)了這11個(gè)候選基因的mRNA水平，結(jié)果表明在病例組織中，除HAND1基因表達(dá)上調(diào)外，其它基因的表達(dá)均顯著低于正常組p<0.05)。
　　 總之，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)法洛四聯(lián)癥患者右心室流出道梗阻部位心肌組織的基因組整體甲基化水平顯著低于正常組，同時(shí)，該疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)隨著甲基化程度的降低而顯著增加；甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT1和DNMT3B表達(dá)水平的顯著降低可能與