HIRA基因在法洛四聯(lián)癥發(fā)病中作用機制初步研究.pdf

1、先天性心臟?。ê喎Q先心?。┦翘浩谛呐K及大血管發(fā)育異常所致的先天性畸形，發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒中占6‰～10‰。我國每年約出生15萬先心病患兒，造成社會家庭嚴重的精神經(jīng)濟負擔。青紫型先心病是先心病中最嚴重的類型，畸形復雜，可致頑固性低氧血癥，未經(jīng)治療，早期死亡率高達80％。圓錐動脈干畸形占青紫型先心的60％～70％。法洛四聯(lián)癥是圓錐動脈干畸形最常見的類型，約占所有先心病的12％，基本病理改變?yōu)橛沂伊鞒龅拦Ｗ琛⑹议g隔缺損、主動脈騎跨及右心室肥厚

2、。研究其發(fā)病機制有利于預防、產(chǎn)前診斷及早期干預，對于減輕社會家庭精神、經(jīng)濟負擔有重要意義。
　　目前普遍接受的觀點為先心病是內(nèi)在遺傳易感因素和外界環(huán)境致畸因素共同作用的結果。先心病候選基因的研究是目前先心病發(fā)病機制研究的熱點。圓錐動脈干畸形是遺傳綜合癥DiGeroge綜合癥(DGS)的主要心臟表現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)，80％～100％DGS患者伴染色體22q11.2的單倍體微缺失。目前該區(qū)域已分離出20～30個候選基因，HIRA基因位于該區(qū)

3、域，作為DGS的候選基因之一，受到廣泛關注。在動物實驗中，下調(diào)雞胚HIRA在神經(jīng)嵴細胞中表達，90％雞胚發(fā)生永存動脈干畸形;下調(diào)小鼠HIRA基因表達，小鼠心臟袢化失敗。法洛氏四聯(lián)癥作為最常見的圓錐動脈干畸形，也是22q11.2微缺失的常見表型。據(jù)此推測，HIRA基因可能是TOF的候選基因。但是人類TOF與HIRA的相關研究非常有限。本課題組前期通過TOF患兒右室流出道心肌HIRA基因表達研究發(fā)現(xiàn)HIRA基因在TOF患兒表達較正常降低。其

4、表達降低的原因有待于進一步探討。
　　本課題擬對法四患兒HIRA基因進行編碼區(qū)序列分析，探討HIRA蛋白結構變化與TOF發(fā)生的關系;同時分析HIRA基因3'UTR區(qū)序列，探尋可能與3'UTR區(qū)結合的micro RNAs，找出TOF患兒右室流出道心肌HIRA表達降低的原因。初步解釋HIRA基因在TOF發(fā)病中的作用機制。
　　第一部分 HIRA基因編碼區(qū)序列分析
　　目的:
　　對中國TOF患兒中HIRA基因編碼區(qū)進

5、行序列分析，探討HIRA基因編碼區(qū)變異與TOF的關系。
　　方法:
　　收集TOF患兒外周血278例及年齡和性別與病例組盡量匹配的健康兒童外周血500例，提取基因組DNA，對HIRA基因全部編碼區(qū)進行測序，突變位點病例組擴大到500例，對氨基酸的改變進行生物信息學預測，將野生型HIRA基因mRNA與突變后mRNA注入斑馬魚單細胞時期后觀察斑馬魚表型進行突變功能驗證。
　　結果:
　　1.在12外顯子發(fā)現(xiàn)1個已報導

6、的SNP c.G1339GA(rs150603624)，其發(fā)生頻率與NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫報導的頻率無統(tǒng)計學差異。
　　2.第17外顯子發(fā)現(xiàn)1個突變c.C2301CA，頻率為1/500，用生物信息學網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)其氨基酸改變對其蛋白質(zhì)功能影響不大，在物種間保守性不高，推測該突變可能為良性突變。
　　3.第23外顯子發(fā)現(xiàn)1個突變c.C3026CT，頻率為2/500，生物信息學網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)其氨基酸改變對其蛋白質(zhì)功能影響大，突變

7、位點在不同特種間高度保守，推測該突變可能為致病性突變，突變mRNA注射后斑馬魚的心臟畸形發(fā)生率明顯高于野生型。
　　小結:
　　HIRA基因23外顯子突變c.C3026CT可能為致病性突變，可能導致先心病的發(fā)生。
　　第二部分 HIRA基因3'UTR序列分析及相關micro RNAs研究
　　目的:
　　對中國TOF患兒HIRA基因3'UTR進行序列分析，探討HIRA基因3'UTR序列變異對調(diào)控其micro

8、 RNAs的影響。
　　方法:
　　收集TOF患兒外周血278例及年齡和性別與病例組盡量匹配的健康兒童外周血500例，提取基因組DNA，對HIRA3'UTR進行測序，用生物信息學網(wǎng)站預測SNP位點周圍的micro RNAs，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)及real-timePCR檢測micro RNA與HIRA3'UTR的相互作用。
　　結果:
　　1.HIRA基因3'UTR SNP(rs:117447448)位點

9、的分布在病例組和對照組中存在統(tǒng)計學差異(P=0.001)。
　　2.在線預測SNP(rs:117447448)位點上游8 bp存在microRNA328的結合位點。
　　3.共同轉染p-silencer+miR328質(zhì)粒和pgl3-promoter+HIRA3'UTR質(zhì)粒293細胞熒光素酶的活性(0.0125±0.0006)低于單獨轉染pgl3-promoter+HIRA3'UTR質(zhì)粒的活性(0.01963±0.0038)，

10、其差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0327)。轉染p-silencer+miR328質(zhì)粒的293T細胞HIRA基因的表達(1.03961±0.0772)較轉染p-silencer空載質(zhì)粒的表達(1.60865±0.2749)降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.037)。
　　4.用SNP(rs:117447448)位點不同基因型的質(zhì)粒與miR328共同轉染293細胞，不同基因型的熒光素酶活性無統(tǒng)計學差異(P=0.38)
　　小結: