hUCMSCs移植對圍絕經期大鼠卵巢儲備功能影響的實驗研究.pdf

1、[目的]
　　1.探討人臍帶間充質干細胞(hUCMSCs)移植對自然衰老圍絕經期SD大鼠（以下簡稱圍絕經期SD大鼠）卵巢儲備功能的影響;
　　2.探討hUCMSCs移植對圍絕經期SD大鼠卵巢組織形態(tài)學、細胞超微結構和細胞凋亡的影響;
　　3.探討hUCMSCs移植提高圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能的可能途徑;
　　4.探討hUCMSCs移植到圍絕經期SD大鼠體內的安全性及可行性。
　　[方法]
　　陰道

2、脫落細胞涂片法監(jiān)測動情周期變化，篩選出30只月齡13～15個月的SPF級圍絕經期SD大鼠模型，隨機分為A、B、C組（每組10只），所有圍絕經期SD大鼠生活條件及喂養(yǎng)方式相同。A組不予處理，B組經尾靜脈移植濃度為1×106細胞/ml的hUCMSCs單細胞懸液1ml，隔日1次，共2次;C組與B組相同方法和實驗時間移植細胞緩沖液（以下簡稱PBS液）1ml。于成模時，實驗時間7d和14d時（即B組和C組末次移植后7d和14d時）檢測各組圍絕經期

3、SD大鼠激素:E2、P、LH、FSH的水平，INHB、AMH水平，觀察實驗時間7d、14d時各組圍絕經期SD大鼠卵巢組織形態(tài)學、細胞超微結構的變化和細胞凋亡情況。
　　[結果]
　　1.SD大鼠陰道脫落細胞的變化:連續(xù)10天呈現(xiàn)動情周期的紊亂、持續(xù)動情或間期延長等變化，證實入選的SD大鼠為圍絕經期模型。
　　2.實驗期間圍絕經期SD大鼠一般情況:3組圍絕經期SD大鼠精神、飲食、毛色、活動等情況良好，無出血等明顯不良反應

4、，無死亡發(fā)生，移植組無明顯排斥反應。
　　3.圍絕經期SD大鼠血清AMH、INHB變化:3組圍絕經期SD大鼠成模時及實驗時間7d時（即B組和C組末次移植后7d時）的AMH、INHB水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;B組圍絕經期大鼠的AMH、INHB水平隨移植時間延長逐漸上升，末次移植后14d時與末次移植后7d時、成模時比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗時間14d時（即B組和C組末次移植后14d時），B組與A、C組

5、圍絕經期大鼠的AMH、INHB水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);A組和C組比較差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著實驗時間延長，A、C組圍絕經期SD大鼠的AMH、INHB水平逐漸下降，實驗時間14d時顯著低于成模時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明hUCMSCs移植后，在圍絕經期SD大鼠體內環(huán)境中末次移植后14d時比7d時對AMH、INHB水平產生影響大。因此本研究推測，hUCMSCs末次移植后14天時圍絕經期SD大

6、鼠AMH、INHB水平明顯提高，可能是圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能提高了的表現(xiàn)之一。提示hUCMSCs移植對延緩圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能下降有積極意義。
　　4.圍絕經期SD大鼠血清性激素變化:3組圍絕經期SD大鼠成模時及實驗時間7d時E2、P、FSH、LH水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;B組圍絕經期SD大鼠E2、P水平隨移植時間延長逐漸上升，末次移植后14d時與末次移植后7d時、成模時比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.

7、05)。B組圍絕經期SD大鼠FSH、LH水平隨移植時間延長逐漸下降，末次移植后14d時與末次移植后7d時、成模時比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。實驗時間14d時，B組與A組和C組圍絕經期SD大鼠E2、P、FSH、LH水平比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;A組和C組比較差異則無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。隨著實驗時間延長，A、C組圍絕經期SD大鼠E2、P水平逐漸下降，在實驗時間14d時顯著低于成模時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0

8、5）。隨著實驗時間延長，A、C組圍絕經期SD大鼠FSH、LH水平逐漸上升，在實驗時間14d時顯著高于成模時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。因此本研究推測，hUCMSCs移植一定時間后對圍絕經期SD大鼠性激素變化產生顯著影響，可能是圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能提高了的表現(xiàn)之一。提示hUCMSCs移植一定時間后能改善圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能。
　　5.光鏡:HE染色后光鏡觀察，在實驗時間7d，3組圍絕經期SD大鼠卵巢的形態(tài)學表

9、現(xiàn)為卵巢間質致密，各期卵泡細胞較少，黃體發(fā)育不良且數(shù)目較少，可見較多的閉鎖卵泡，多數(shù)顆粒細胞消失。實驗時間14d時B組與A、C組比較:光鏡下可見卵巢皮質內卵泡形成的狀況有所改善，各級卵泡細胞增多;黃體數(shù)量及發(fā)育狀況與A、C組比較數(shù)目增多，閉鎖卵泡減少。形態(tài)學證實hUCMSCs移植一定時間后圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功能有所改善。
　　6.電鏡:電鏡觀察，實驗時間7d時，3組圍絕經期SD大鼠卵巢組織的卵泡內可見顆粒細胞內線粒體較少、腫

10、大，空變及髓鞘樣變，滑面內質網不豐富，內質網腫脹擴張，高爾基體肥大。顆粒細胞凋亡，胞質濃縮，線粒體、溶酶體空泡化等細凋亡小體形成。實驗時間14d時與A、C組比較，B組電鏡下卵巢卵泡內可見顆粒細胞多層，呈立方形，顆粒細胞內線粒、滑面內質網較多，結構較前趨于正常，凋亡小體數(shù)目減少。核孔增大，核孔與細胞代謝活性有改善。hUCMSCs移植后一定時間后，可見卵巢組織細胞內各細胞器形態(tài)結構趨于更佳代謝狀態(tài)。提示hUCMSCs移植一定時間后卵巢細胞的

11、超微結構有所改善。
　　7.卵巢組織細胞凋亡情況:免疫熒光染色后觀察，實驗時間14d時，3組圍絕經期SD大鼠凋亡細胞數(shù)比較，A、C組中的凋亡細胞數(shù)量明顯增多，而且大部分都是卵泡周邊及內部的顆粒細胞。B組卵泡內外凋亡細胞數(shù)均明顯減少，卵泡內只有少數(shù)凋亡細胞。hUCMSCs移植一定時間后減少凋亡細胞的數(shù)量是改善圍絕經期SD大鼠卵巢的功能可能途徑之一。
　　[結論]
　　1.hUCMSCs移植對改善圍絕經期SD大鼠卵巢儲備功