2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥(OP)是嚴(yán)重威脅中老年人群，尤其足絕經(jīng)后女性的一種全身性骨病，如何有效防治骨質(zhì)疏松已成為當(dāng)今國(guó)內(nèi)外學(xué)者熱切關(guān)注的課題。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMOP)是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的最常見(jiàn)類(lèi)型，發(fā)生于絕經(jīng)后女性，雖然目前尚無(wú)確切流行病學(xué)資料數(shù)據(jù)，但美國(guó)第3次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)與健康調(diào)查顯示，全國(guó)50歲以上女性O(shè)P患病率13％-18％。加拿大OP多中心研究隨機(jī)調(diào)查結(jié)果顯示女性腰椎OP和股骨頸OP患病率分別為12.1％和7.9％，總患病率為15.

2、8％。20世紀(jì)90年代，歐洲29個(gè)研究中心（英國(guó)后來(lái)也加入）進(jìn)行前瞻性O(shè)P研究（骨密度測(cè)量和腰椎變形研究），根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)診斷標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量50歲以上女性人群股骨頸和粗隆間骨密度，結(jié)果顯示歐洲女性O(shè)P患病率為2％-11％，挪威50歲以上婦女中有14％-36％患OP。我國(guó)學(xué)者采用分層多階段整群抽樣方法對(duì)中國(guó)五大行政區(qū)的40歲以上人群進(jìn)行調(diào)查，應(yīng)用雙能X線(xiàn)骨密度儀（DXA）測(cè)量骨密度(BMD)，并按照WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)OP總患病率為

3、12.4％，其中男性為8.5％，女性為15.7％，兩者之間的籌異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，機(jī)體的骨重建失衡目前被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松發(fā)生的根本機(jī)制。骨重建是指去除骨骼局部舊骨代之以形成新骨的過(guò)程，足成熟骨組織的一種重要替換機(jī)制，是破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞一個(gè)成對(duì)的、相耦聯(lián)的細(xì)胞活動(dòng)過(guò)程。破骨細(xì)胞(OC)是骨吸收的主要細(xì)胞，它的多少及活性直接決定骨吸收能力。成骨細(xì)胞(OB)足促進(jìn)骨形成的細(xì)胞。骨吸收和骨形成的速率構(gòu)成骨

4、轉(zhuǎn)換率。骨重建過(guò)程受到遺傳、內(nèi)分泌、年齡和細(xì)胞因子等諸多因素影響，女性絕經(jīng)是骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要病因之一，越來(lái)越多的證據(jù)表明T2DM影響骨代謝，造成骨轉(zhuǎn)換率及骨量改變，使骨折危險(xiǎn)性升高，T2DM對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的骨重建及骨轉(zhuǎn)換影響還不清楚。在維持骨重建的動(dòng)態(tài)平衡中，系統(tǒng)或局部骨高長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路在成骨細(xì)胞的發(fā)育及分化過(guò)程中扮演重要角色。人類(lèi)遺傳學(xué)和動(dòng)物研究表明，Wnt/低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(LRP5)

5、/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是骨量形成的重要調(diào)節(jié)因子。tunt相關(guān)基因2（Runx2）是骨形成的關(guān)鍵基因，Runx2的表達(dá)是成骨細(xì)胞開(kāi)始分化的標(biāo)志。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Wnt/LRP5/β-catenin涉及Runx2活性或表達(dá)的調(diào)控。而核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路是在破骨細(xì)胞分化時(shí)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，核因子-1（B受體活化因子配體(RANKL)的信號(hào)可經(jīng)核因子-κB受體活化因子(RANK)傳遞給連接蛋白腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(T

6、RAF6)活化NF-κB，NF-κB再通過(guò)下游的活化T細(xì)胞核因子1蛋白(NFATc1)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成。因此Wnt和NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)因子表達(dá)改變可影響骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。
　　 我國(guó)2型糖尿病(T2DM)患病率快速增長(zhǎng)，且年齡越大，患病率越高。資料顯示2型糖尿病影響骨轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性增高。2型糖尿病和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松關(guān)系并不清楚。本研究通過(guò)制備2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型，測(cè)定骨密度及骨轉(zhuǎn)換生

7、化標(biāo)記物，體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，觀(guān)察骨組織基因mRNA表達(dá)，并結(jié)合臨床試驗(yàn)探討2型糖尿病骨質(zhì)疏松癥特點(diǎn)，為闡明2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生的分子學(xué)機(jī)制及防治提供一條新思路。
　　 方法：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
　　 第一部分：健康雌性Wistar大鼠100只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對(duì)照組(NS，n=24)，去卵巢組(NOVX，n=26)，2型糖尿病組(DS，n=24)，2型糖尿病去卵巢組(DOVX，n=26)，組間

8、大鼠體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中糖尿病組(DS和DOVX)高糖高脂飼料（常規(guī)飼料中加入20％蔗糖、15％熟豬油、2.5％膽固醇）喂養(yǎng)8周后腹腔給予鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ0.1mmol/L，檸檬酸鈉配制，pH4.2)30mg/kg注射制備2型糖尿病動(dòng)物模型，無(wú)糖尿病組(NS和NOVX)注射相同體積的檸檬酸緩沖液。1周后選取尾靜脈取血測(cè)空腹血糖(FBG)≥7.8mmol/L確定為T(mén)2DM動(dòng)物模型，糖尿病模型復(fù)制成功1周后

9、無(wú)菌條件下NOVX和DOVX組大鼠麻醉后行雙側(cè)卵巢切除手術(shù)，NS和DS組僅去除部分脂肪，以去卵巢術(shù)當(dāng)天為基值，0周各組大鼠測(cè)血糖(FBG)、胰島素(FINS)，計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(IAI)。0、4、8和12周末雌激素(E2)水平、腰椎骨密度(BMD)。
　　 第二部分：于去卵巢術(shù)后第0、4、8、12周末每組大鼠隨機(jī)選取5只拉頸處死行成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀(guān)察成骨細(xì)胞數(shù)量、形態(tài)變化，傳代至第三代時(shí)堿性磷酸酶染色鑒

10、定成骨細(xì)胞，并用MTT法判斷成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力。破骨細(xì)胞培養(yǎng)7天后，固定細(xì)胞，抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色，倒置相差顯微鏡下每孔計(jì)數(shù)。同期內(nèi)眥靜脈取血測(cè)定骨特異性堿性磷酸酶(BALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)濃度。
　　 第三部分：于去卵巢術(shù)后第4、8、12周末，每組大鼠隨機(jī)選取5只分離脛骨置液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆?，提取總RNA時(shí)取出骨組織約100mg快速放入研缽中，加1mL Trizol裂解液磨碎，參

11、照Trizol RNA提取試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后以適量cDNA為模板擴(kuò)增Runx2、LRP5、β-catenin、TRAF6、NF-κB、NFATc1的mRNA表達(dá)。 PCR產(chǎn)物在8％聚丙烯酰胺凝膠上200v恒壓電泳1h，溴化乙錠溶液染色10min，應(yīng)用凝膠成像圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度掃描，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量與β-actin比值。
　　 臨床試驗(yàn)部分：選取150例門(mén)診查體無(wú)糖尿病絕經(jīng)后女性，年齡50-70歲，絕經(jīng)年限2-14年；15

12、0例該院內(nèi)分泌科住院2型糖尿病女性絕經(jīng)患者，年齡48-70歲，絕經(jīng)年限1-14年，符合1999年WHO糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。雙能X線(xiàn)骨密度測(cè)定儀(DXA)測(cè)定兩組人群腰椎2-4(L2-4)、股骨頸Neck)、大轉(zhuǎn)子(Great T)、粗隆間(InterTro)骨密度(BMD)，比較各部位骨量及骨質(zhì)疏松發(fā)生率情況。依照1998年WHO原發(fā)性骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)，將糖尿病組所有入選患者分為骨量正常組(NP)、骨量減低組(DP)和骨質(zhì)疏松組(OP)，登

13、記年齡(Age)，絕經(jīng)年限(PMD)，糖尿病病程(DMD)，測(cè)定身高、體重，計(jì)算體重指數(shù)(BMI)。隨機(jī)血樣測(cè)定糖化血紅蛋白(HbA1c)。靜脈血化驗(yàn)空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FIns)、雌激素(E2)，Ⅰ型膠原C端肽(CTX-I)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、骨特異性堿性磷酸酶(BALP)。探討絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松發(fā)生的影響因素和骨轉(zhuǎn)換特點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第一部分：①血糖(F

14、BG):0周時(shí)糖尿病組(DS、DOVX)大鼠FBG顯著高于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)。②胰島素(INS)和胰島素敏感指數(shù)(IAI):0周時(shí)糖尿病組(DS、DOVX)大鼠胰島素明顯高于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)，0周時(shí)糖尿病組(DS、DOVX)大鼠胰島素敏感指數(shù)均明顯低于非糖尿病組(NS、NOVX)(p＜0.05)。③雌激素(E2)：0周時(shí)DOVX和DS組大鼠明顯低于NOVX和NS組（p＜0.05）；4

15、、8和12周時(shí)DOVX組大鼠明顯低于NS、NOVX和DS組（p＜0.05），NOVX組大鼠明顯低于NS組（p＜0.05）；8和12周DS組大鼠明顯低于NS組（p＜0.05）。④骨密度(BMD):4、8和12周DOVX、NOVX組大鼠骨密度均明顯低于NS組與DS組（p＜0.05），8和12周DS組大鼠明顯低于NS組(p＜0.05)。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第二部分：①BALP:0周時(shí)各組大鼠血清BALP均未見(jiàn)明顯差異(p＞0.05)。4周

16、時(shí)DOVX組大鼠血清BALP濃度與NS組比較無(wú)明顯差異（p＞0.05），與NOVX組比較明顯減低(p＜0.05)，與DS組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)；NOVX組大鼠血清BALP濃度明顯高于NS組(p＜0.05)；DS組血清BALP濃度與NS組比較無(wú)明顯差異（p＞0.05）。8周時(shí)DOVX組大鼠血清BALP濃度與NS和NOVX組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)，與DS組比較明顯升高(p＜0.05)；NOVX組血清BALP濃度與NS組比較

17、無(wú)明顯差異(p＞0.05)；DS組血清BALP濃度明顯低于NS組（p＜0.05）。12周時(shí)各組血清BALP濃度均無(wú)明顯差異（p＞0.05）。②TRACP5b：0周時(shí)各組大鼠血清TRACP5b均未見(jiàn)明顯差異(p＞0.05)。4周和8周時(shí)DOVX組TRACP5b濃度均明顯高于NS組（p＜0.05），與DS組和NOVX組比較均無(wú)明顯差異（p＞0.05）；NOVX組TRACP5b濃度明顯高于NS組(p＜0.05);DS組TRACP5b濃度明顯高

18、于NS組（p＜0.05）。12周時(shí)DOVX組TRACP5b濃度明顯高于NS組、NOVX組、DS組（p＜0.05）：NOVX和DS組TRACP5b濃度分別與NS組比較均無(wú)明顯差異（p＞0.05）。③成骨細(xì)胞增殖活力：4、8和12周時(shí)DOVX組大鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力與NS組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)，與NOVX組比較明顯減低(p＜0.05)，與DS組比較明顯增高(p＜0.05);NOVX組大鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力明顯高于NS組(p＜0.05)

19、;DS組大鼠成骨細(xì)胞生長(zhǎng)活力明顯低于NS組（p＜0.05）。④破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)：4、8和12周時(shí)DOVX組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于NS和DS組(p＜0.05);NOVX組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于NS組(p＜0.05);DS組大鼠破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯高于NS組(p＜0.05)。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)第三部分：①Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)：4、8和12周時(shí)DOVX大鼠LRP5和3-catenin表達(dá)均明顯低于NS組(p＜0.05)；4周時(shí)DOVX

20、大鼠Runx2表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯差異（p＞0.05），8和12周時(shí)DOVX大鼠Runx2表達(dá)均明顯低于NS組(p＜0.05)。4、8和12周時(shí)NOVX大鼠LRP5和β-catenin表達(dá)均明顯低于NS組(p＜0.05)；4和12周時(shí)NOVX大鼠Runx2表達(dá)明顯低于NS組(p＜0.05)，8周時(shí)NOVX大鼠Runx2表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯差異（p＞0.05）。4和8周時(shí)DS組大鼠LRP5和β-catenin表達(dá)均明顯低于NS組(p＜

21、0.05)，12周時(shí)DS組大鼠LRP5表達(dá)明顯低于NS組（p＜0.05），β-catenin表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯差異。4和8周時(shí)DS組大鼠Runx2表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)，12周時(shí)DS組大鼠Runx2表達(dá)明顯低于NS組。②NF-κB信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)：4、8和12周時(shí)DOVX組大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表達(dá)均明顯高于NS組。4周時(shí)NOVX組大鼠TRAF6表達(dá)明顯低于NS組(p＜0.05)，NF-κB

22、表達(dá)明顯高于NS組，NFATc1表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯改變，8和12周時(shí)NOVX組大鼠TRAF6、NF-κB和NFATc1表達(dá)均明顯高于NS組。4周時(shí)DS組大鼠TRAF6表達(dá)明顯低于NS組，NF-κB和NFATc1表達(dá)均明顯高于NS組；8周時(shí)DS大鼠TRAF6表達(dá)與NS組比較無(wú)明顯改變(p＞0.05)，NF-κB和NFATc1表達(dá)均明顯低于NS組；12周時(shí)DS組大鼠TRAF6和NF-κB表達(dá)明顯高于NS組，NFATc1表達(dá)與NS組比較無(wú)

23、明顯變化。
　　 臨床研究部分：①絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松患病率為54％;②絕經(jīng)后2型糖尿病患者各部位骨量與無(wú)糖尿病患者比較無(wú)明顯差異；③絕經(jīng)后2型糖尿病骨質(zhì)疏松組患者年齡、絕經(jīng)年限、糖尿病病程及空腹血糖水平明顯高于骨量減少和骨量正常組，胰島素和雌激素水平明顯低于骨量減少和骨量正常組；年齡、絕經(jīng)年限、糖尿病病程及空腹血糖與骨密度呈負(fù)相關(guān)，胰島素和雌激素水平與骨密度呈正相關(guān)；④2型糖尿病骨質(zhì)疏松組患者CTX-I、TRACP5b

24、、BALP水平明顯高于骨量減少和骨量正常組，CTX-I與腰椎2-4、股骨頸骨密度呈明顯負(fù)相關(guān)，與大轉(zhuǎn)子、粗隆間骨密度無(wú)明顯相關(guān)性；TRACP5b、BALP與腰椎2-4、股骨頸、大轉(zhuǎn)子、粗隆間骨密度呈明顯負(fù)相關(guān)，TRACP5b與各部位骨密度相關(guān)性最強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 1、實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠雙側(cè)卵巢切除4周成功建立2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠模型；
　　 2、2型糖尿病大鼠骨量低于正常大鼠；2型糖尿病卵巢切除大鼠骨

25、量與卵巢切除大鼠骨量無(wú)明顯差異：
　　 3、2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠重建特點(diǎn)表現(xiàn)為：骨形成穩(wěn)定，骨吸收活躍，其發(fā)生發(fā)展與糖尿病和卵巢切除有關(guān)；
　　 4、Wnt信號(hào)通路與NF-κB通路影響2型糖尿病骨質(zhì)疏松大鼠骨重建，Wnt信號(hào)通路中β-catenin表達(dá)下降與NF-κB通路中NF-1B表達(dá)增強(qiáng)可能為2型糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要分子生物學(xué)機(jī)制之一；
　　 5、絕經(jīng)后2型糖尿病患者骨質(zhì)疏松患病率54％。年齡增長(zhǎng)、絕經(jīng)