低溫誘發(fā)肉雞腹水綜合征的分子機(jī)制及VC的緩解作用.pdf

1、本文考察了飼糧VC添加對低溫誘導(dǎo)條件下肉雞生長性能、心臟指數(shù)、血常規(guī)、抗氧化能力、肺血管重構(gòu)(Pulmonary vascular remodeling，PVR)和缺氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)等缺氧相關(guān)基因表達(dá)的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索了CoCl2模擬缺氧對肉雞肺動脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arteries smoothmuscle cells，PASMC)中HIF

2、-1α、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管內(nèi)皮生長因子受體-2（Vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2/Flk-1）基因表達(dá)水平的影響，為下一步繼續(xù)探索VC緩解肉雞腹水綜合征(Ascites syndrome，AS)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。因此，本論文包括兩個試驗。
　　試驗一:低溫與飼糧VC添加對

3、1-21d肉雞機(jī)體抗氧化性能、HIF-1α基因表達(dá)及肺血管重構(gòu)的影響
　　選用400只1d科寶肉公雞，按照初始體重?zé)o差異原則隨機(jī)分為4個處理，處理1-4分別為低溫組（Low ambient temperature，LAT）、低溫+VC(1000mg/kg)組(LAT+VC)、常溫組(Normal ambient temperature，NAT)、常溫+VC(1000mg/kg)組(NAT+VC)。每個處理10個重復(fù)，每個重復(fù)10只

4、雞。試驗期為21d。LAT組和LAT+VC組的飼養(yǎng)溫度在試驗第1-7d為24℃-26℃，第8-21d為9℃-11℃，NAT組和NAT+VC組的飼養(yǎng)溫度在試驗第1-7d為29℃-31℃，在試驗第8-21d為24℃-26℃。結(jié)果表明:1）低溫增加了試驗全期的料肉比(Feed-to-gain ratio，F(xiàn)/G)(P＜0.01)，增加了21d肉雞的心臟指數(shù)(P＜0.05)，以及14d肉雞的紅細(xì)胞壓積(Hematocrit，HCT)和血紅蛋白(

5、Hemoglobin，HGB)水平（P＜0.05）;飼糧VC的添加增加了21d肉雞的HCT、HGB水平以及紅細(xì)胞（Red blood cell，RBC）計數(shù)(P＜0.05)。2）低溫降低了21d肉雞血清、肝臟和肺臟總抗氧化能力(Total antioxidantcapacity,T-AOC)(P＜0.05)，增加了肉雞血清和肝臟中VC含量、肝臟和肺臟中蛋白質(zhì)羰基化水平以及肺臟丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量(P＜0.

6、05); VC的添加有提高肉雞血清T-AOC的趨勢（P＜0.1）。3）低溫增加了21d肉雞肺血管中膜面積與總管面積的比值(Vessel wall area to Vessel total area，WA/TA，％)和肺動脈平均中膜厚度占血管外徑的比值(Mean media thickness in pulmonary arterioles，mMTPA，％)（P＜0.05）;飼糧VC的添加降低了肉雞肺血管mMTPA(P＜0.05)，但對W

7、A/TA的影響不顯著。4）低溫提高了21d肉雞肺臟組織HIF-1α、VEGF及Flk-1 mRNA的相對表達(dá)量(P＜0.05)，低溫組添加VC后降低了肺臟組織HIF-1α、VEGF和Flk-1 mRNA的相對表達(dá)量（P＜0.05）。5）21d肉雞肺臟組織中HIF-1α、VEGF和Flk-1 mRNA水平三者之間互為正相關(guān)(P＜0.01);VEGF mRNA的相對表達(dá)量與肺血管WA/WT和mMTPA值呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)。以上結(jié)果

8、提示，低溫導(dǎo)致1-21d肉雞機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激，誘發(fā)了21d肉雞肺血管重構(gòu)，提高了HIF-1α、VEGF和Flk-1基因表達(dá)，飼糧VC添加對21d肉雞機(jī)體抗氧化能力提升不顯著，但降低了HIF-1α、VEGF和Flk-1基因表達(dá)和血管重構(gòu)。
　　試驗二:CoCl2模擬缺氧對肉雞肺動脈平滑肌細(xì)胞中HIF-1α，VEGF及Flk-1基因表達(dá)水平的影響
　　本試驗選用21d科寶肉公雞，用組織塊貼壁法進(jìn)行肉雞PASMC的原代培養(yǎng)。雞只處

9、死后取出肺動脈血管，剝離出中膜后剪碎成小組織塊并放入培養(yǎng)瓶中貼壁，37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過α-actin免疫熒光染色法對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。對PASMC進(jìn)行傳代培養(yǎng)，通過添加CoCl2模擬細(xì)胞缺氧狀態(tài)，CoCl2溶液濃度分別為100、200、250、500以及1000μmol/L四種濃度，設(shè)置6、12、24、48h四個時間水平，每個時間點(diǎn)以不含CoCl2的陰性培養(yǎng)基做為對照組，相應(yīng)時間點(diǎn)收集細(xì)胞，測定細(xì)胞HIF-1α mRNA相

10、對表達(dá)量，同時測定處理48h時陰性對照組和CoCl2溶液濃度為250和1000μmol/L的細(xì)胞VEGF和Flk-1mRNA的相對表達(dá)量。用MTT法測定細(xì)胞增殖水平。試驗結(jié)果:1）組織塊貼壁5-6d后逐漸有細(xì)胞爬出，7-10d后細(xì)胞形成典型的“峰-谷”狀。2）細(xì)胞免疫熒光顯示，平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中特有的肌動蛋白呈現(xiàn)出紅色熒光。3）CoCl2處理時間及其濃度對PASMC中HIF-1αmRNA的相對表達(dá)有顯著影響（P＜0.05），其中用25

11、0、500和1000μmol/L濃度CoCl2處理12、24、48h后，PASMC的HIF-1α mRNA的相對表達(dá)均顯著增加，其中以250μmol/LCoCl2處理48h最高（P＜0.01）。4)CoCl2處理時間對細(xì)胞增殖的影響顯著（P＜0.001），各濃度CoCl2處理的細(xì)胞隨時間的增加細(xì)胞增殖增大，48h達(dá)到最大（P＜0.01）。5）CoCl2濃度為250μmol/L和1000μmol/L下處理48h，細(xì)胞VEGF mRNA相對

12、表達(dá)量均有高于CoCl2濃度為0μmol/L的處理的趨勢(P＜0.1);在CoCl2濃度250μmol/L和1000μmol/L下處理48h時，細(xì)胞Flk-1的表達(dá)量均高于CoCl2濃度為0μmol/L的處理，但差異不顯著(P＞0.05)。以上結(jié)果提示，用組織塊貼壁法可以成功培養(yǎng)出肉雞PASMC，用250μmol/L CoCl2溶液可以成功誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧，并可在一定程度上提高細(xì)胞HIF-1α、VEGF和Flk-1基因的表達(dá)，在細(xì)胞水平上證