Fechtner綜合征的臨床及分子機制研究.pdf

1、Fechtner綜合征是一種常染色體顯性遺傳的巨大血小病，其臨床表現(xiàn)為血小板巨大，血小板減少和中性粒細胞包涵體，腎小球腎炎和/或聽力喪失、白內(nèi)障。非肌性肌球蛋白重鏈9基因（MYH9）基因突變是導(dǎo)致Fechtner綜合征發(fā)病的分子機制。MYH9編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA（NMMHC—ⅡA），非肌性肌球蛋白ⅡA表達于多種細胞和組織，它參與了多種細胞的功能包括細胞質(zhì)分裂、細胞運動和維持細胞的形態(tài)。大多數(shù)細胞都可表達非肌性肌球蛋白重鏈的三種亞型

2、ⅡA、ⅡB和ⅡC，如腎臟、耳蝸和晶狀體，而中性粒細胞和血小板只表達NMMHC—ⅡA。至今為止，對Fechtner綜合征的發(fā)病機制及非肌性肌球蛋白ⅡA的功能了解較少。我們診斷了國內(nèi)首例遺傳性Fechtner綜合征家系并對其進行了臨床特征和分子診斷、腎臟病變的機理和非肌性肌球蛋白ⅡA功能等方面的研究。上述研究對深入認識MYH9綜合征的發(fā)病機理和非肌性肌球蛋白ⅡA的功能有重要意義。 目的：對1例遺傳性Fechtner綜合征家系進行臨床

3、特征和分子診斷、腎臟病變的機理和非肌性肌球蛋白ⅡA功能等方面的研究。以期初步闡明Fechtner綜合征發(fā)病的分子機制。 方法：1．外周血片觀察血小板和中性粒細胞形態(tài)，提取Fechtner綜合征家系先證者及其家系成員外周血基因組DNA，PCR法擴增其MYH9基因所有40個外顯子和側(cè)翼序列，DNA序列分析確定MYH9基因異常。2．透射電鏡觀察Fechtner綜合征先證者血小板和中性粒細胞的超微結(jié)構(gòu)。3．間接免疫熒光方法結(jié)合DAPI復(fù)

4、染細胞核的技術(shù)觀察中性粒細胞包涵體的形態(tài)。4．HE染色、免疫組化、免疫熒光和電鏡對Fechtner綜合征患者的腎臟病變進行了研究。5．半定量Western—Blot檢測中性粒細胞非肌性肌球蛋白ⅡA的表達。以人胚腎細胞（HEK—293）為研究對象對ⅡA、ⅡB之間的相互作用進行了探討。RT—PCR法檢測HEK—293細胞中非肌性肌球蛋白ⅡA、ⅡB的表達，并對其進行了免疫共沉淀的研究。 結(jié)果：1．外周血片可見巨大血小板，其中中等大（4

5、—7μm）血小板占血小板的53%，巨大血小板（>7μm）占9%。中性粒細胞胞漿中出現(xiàn)小的、灰藍色的包涵體。約74%的中性粒細胞可見到中性粒細胞包涵體。PCR產(chǎn)物多次直接測序，均在先證者的MYH9基因外顯子40中發(fā)現(xiàn)第5981位核苷酸由C→T雜合性突變，使第1933位密碼子（CGA，編碼Arg）突變?yōu)榻K止密碼TGA。2．先證者的血小板體積大，致密顆粒、線粒體等顆粒的數(shù)量未見異常。開放管道系統(tǒng)基本正常。中性粒細胞形態(tài)大體正常，但胞漿中存在小

6、的包涵體，不同于其它顆?；蚣毎鞑⑶抑車鸁o膜分隔。放大電鏡倍數(shù)后發(fā)現(xiàn)包涵體內(nèi)為致密結(jié)構(gòu)，包含一些粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并且無顆粒。3．正常對照中性粒細胞胞漿中非肌性肌球蛋白ⅡA呈分散均質(zhì)性分布，無綠色熒光聚集現(xiàn)象。而先證者及家系其他患者中性粒細胞胞漿中均可見明顯團塊狀、半月形的綠色熒光聚集，其大小、位置與瑞氏染色的中性粒細胞包涵體相同。4．患者腎臟標(biāo)本HE染色發(fā)現(xiàn)在12個腎小球中有6個已明顯硬化，其余腎小球的部分節(jié)段系膜細胞輕·中度增生伴基質(zhì)增多，

7、并有少數(shù)節(jié)段與球囊壁粘連。間質(zhì)炎癥細胞小灶性分布，主要圍繞在硬化腎小球周圍，少數(shù)腎小管有蛋白管型。局灶性腎小管上皮細胞腫脹，顆粒變性。腎臟免疫組化觀察到非肌性肌球蛋白ⅡA主要位于腎小球臟層上皮細胞（足細胞）和遠曲小管上皮，微弱表達于近曲小管刷狀緣。與正常腎組織相比，F(xiàn)echtner綜合征患者非肌性肌球蛋白ⅡA在腎小球足細胞的表達減少，非肌性肌球蛋白ⅡA在遠曲小管的表達與正常無差別。腎臟免疫熒光提示患者非肌性肌球蛋白ⅡA在腎小球的綠色熒光

8、強度明顯高于正常人，通過足細胞特異性抗體染色分析，非肌性肌球蛋白ⅡA主要沉積在腎小球足細胞，并且系膜細胞和系膜基質(zhì)輕度增生。患者腎臟標(biāo)本電鏡顯示2個腎小球，其中1個已發(fā)生硬化，另1個為節(jié)段性硬化。腎小球系膜區(qū)有中度電子致密物沉積，伴有局部系膜細胞增生及基質(zhì)增多。足突部分融合伴少量微絨毛形成。5．免疫印跡顯示先證者中性粒細胞ⅡA/β—actin比值為（0．35±0．12）較正常對照中性粒細胞ⅡA/β—actin（0．87±0．18）相比明

9、顯減少，相當(dāng)于正常中性粒細胞的39%（均值39%，范圍：33%—44%），有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0．01）。非肌性肌球蛋白ⅡA、非肌性肌球蛋白ⅡB在HEK—293細胞中均有較高的表達，特異性引物擴增ⅡA的片段大小為331bp，ⅡB的片段大小為492bp。HEK—293細胞裂解液用特異性的非肌性肌球蛋白ⅡA抗體進行免疫共沉淀分析，發(fā)現(xiàn)非肌性肌球蛋白ⅡA和非肌性肌球蛋白ⅡB均有表達。陰性對照兩者均無表達。 結(jié)論： 1．國內(nèi)首次報

10、道Fechtner綜合征家系。 2．國際上首次報道R1933X突變位點同時出現(xiàn)了腎臟病變，證實過去命名的May—Hegglin異常、Sebastian綜合征、Fechtner綜合征和Epstein綜合征是同一種疾病的不同表現(xiàn)。 3．建立了診斷MYH9綜合征的快速簡便的免疫熒光方法，較以往的免疫熒光方法相比，更清晰和方便地顯示中性粒細胞核和包涵體的結(jié)構(gòu)。 4．國際上首次運用HE染色、免疫組化、免疫熒光和電鏡對R19