寧動顆粒及天麻素治療抽動-穢語綜合征的分子機制研究.pdf

1、背景：
　　 抽動-穢語綜合征是一種無意識的、無目的的、重復(fù)的刻板活動為特征的神經(jīng)精神性疾病。臨床表現(xiàn)為頭面、腹部及四肢不自主的抽動，喉部發(fā)出奇特叫聲或罷罵不避親疏為特征。TS有不規(guī)則的發(fā)作間歇期，有時可因轉(zhuǎn)移注意力而減輕，睡眠時癥狀消失，精神緊張時癥狀加重。該病常伴隨注意缺陷、多動沖動或強迫癥狀。TS診斷標(biāo)準(zhǔn)為：1.具有多種運動性抽動及一種或多種發(fā)聲性抽動，有時不一定在同一時間出現(xiàn)。2.抽動每天發(fā)作多次，通常為一陣陣發(fā)作，病情

2、持續(xù)或間斷發(fā)作已超過一年，其無抽動間歇期連續(xù)不超過三個月。3.上述癥狀引起明顯的不安，顯著地影響社交、就業(yè)和其他重要領(lǐng)域的活動。4.發(fā)病于18歲前。5.上述癥狀不是直接由某些藥物或內(nèi)科疾病引起。盡管TS是一種輕癥的神經(jīng)精神疾病，但病程長，反復(fù)發(fā)作，影響正常的生活和學(xué)習(xí)。近于一半的病人抽動癥狀會持續(xù)到18歲以后，甚者部分病人抽動癥狀可以持續(xù)一生，大約有5％的TS病人有影響生存的癥狀，稱之為惡性TS。多巴胺系統(tǒng)的過度活躍和受體超敏感均有可能

3、引起抽動的發(fā)生。因此抑制DA系統(tǒng)功能是治療TS的重要途徑。
　　 TS的發(fā)病與社會心理因素、遺傳因素、中樞神經(jīng)遞質(zhì)的代謝異常等因素有關(guān)。而DA系統(tǒng)功能異常被廣泛認為是導(dǎo)致TS發(fā)病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)。應(yīng)用DA受體激動劑在動物身上能產(chǎn)生突發(fā)、反復(fù)的定型肌肉運動等一系列的酷似TS的癥狀和體征。DA神經(jīng)元主要集中在中腦和基底節(jié)，其中黑質(zhì)、紋狀體DA的密度約占腦內(nèi)DA的80％。位于黑質(zhì)致密層的DA神經(jīng)元接受紋狀體的投射纖維，終止于紋狀體背側(cè)

4、神經(jīng)元；源于腳間核上中線的DA神經(jīng)元終止于中腦邊緣系統(tǒng)通路。黑質(zhì)-紋狀體通路是調(diào)節(jié)一切行為反應(yīng)的基本結(jié)構(gòu)，中腦-中腦邊緣的DA通道平衡失調(diào)致邊緣系統(tǒng)抑制障礙被認為是TS的神經(jīng)生化基礎(chǔ)。腦內(nèi)DA的前體物質(zhì)來源于食物中的酪氨酸，在限速酶酪氨酸羥化酶的作用下生成多巴，后者又在多巴脫羧酶的作用下生成DA。DA在腦內(nèi)主要在單胺氧化酶的作用下降解為高香草酸，排出體外。HVA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中DA的主要代謝產(chǎn)物，通常被作為DA活性的主要指標(biāo)。研究證明T

5、S患者殼核DA釋放量明顯高于對照組，血清及腦脊液中HVA較正常對照組明顯降低，且降低程度與癥狀嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。被釋放的DA分別與紋狀體內(nèi)神經(jīng)元上的多巴胺D1受體和多巴胺D2受體結(jié)合，最終使大腦皮質(zhì)運動區(qū)興奮或去抑制，而產(chǎn)生抽動現(xiàn)象。有研究證明TS患者DA能神經(jīng)系統(tǒng)異常，尤其是DA能神經(jīng)系統(tǒng)過度活躍或突觸后DA受體超敏感，導(dǎo)致慢性反復(fù)出現(xiàn)不自主的動作及發(fā)音上的抽動。DRD2被認為與TS關(guān)系更為密切，TS患者紋狀體內(nèi)DRD2數(shù)目、密度較同

6、年齡、同性別對照明顯升高。綜上研究表明，TS患者紋狀體內(nèi)DA含量升高，其血清中代謝產(chǎn)物HVA含量減少，紋狀體內(nèi)DRD2活性增強。
　　 氟哌啶醇作為DRD2阻滯劑至今仍為治療TS的有效藥物。但氟哌啶醇的副作用相對比較大，其副作用的發(fā)生直接與劑量相關(guān)。常見的副作用有嗜睡、鎮(zhèn)靜、乏力、頭昏、椎體外系反應(yīng)，服用數(shù)月后，可能出現(xiàn)類帕金森氏病的癥狀，如震顫、肌肉僵直等，長期應(yīng)用氟哌啶醇可導(dǎo)致遲發(fā)性運動障礙的發(fā)生，表現(xiàn)為不自主的刻板運動，并

7、具有持續(xù)性。有如此諸多副作用，一定程度上限制了該藥物的臨床應(yīng)用。
　　 寧動顆粒是臨床治療TS的中藥復(fù)方制劑，已應(yīng)用于臨床多年，并顯示出良好的效果。有研究證明天麻素能抑制動物DA系統(tǒng)活性，有顯著的鎮(zhèn)靜、抗癲癇及神經(jīng)保護作用。本課題采用阿樸嗎啡誘導(dǎo)TS大鼠模型，觀察寧動顆粒及天麻素對TS大鼠刻板活動的影響；檢測TS大鼠血清內(nèi)HVA、紋狀體內(nèi)DA含量及DRD2基因及蛋白表達的強弱，初步探討寧動顆粒及天麻素對TS大鼠DA系統(tǒng)的影響，并

8、闡明寧動顆粒及天麻素治療TS的作用機制，為寧動顆粒及天麻素治療TS提供科學(xué)理論依據(jù)。
　　 目的：
　　 1.觀察寧動顆粒及天麻素對TS模型大鼠刻板活動的影響。
　　 2.觀察寧動顆粒對TS模型大鼠紋狀體內(nèi)DA含量、DRD2 mRNA表達和蛋白表達，以及血清中HVA含量的影響。探討寧動顆粒治療TS的作用機制。
　　 3.觀察天麻素對TS模型大鼠血清中HVA含量及紋狀體內(nèi)DRD2 mRNA表達的影響。探討天

9、麻素抑制TS的機制。
　　 方法：
　　 1.研究對象：4周齡雄性Wistar大鼠96只，隨機分為6組，每組16只：(1)空白對照組；(2)阿樸嗎啡組；(3)氟哌啶醇組；(4)寧動顆粒加氟哌啶醇組(NG+Hal)；(5)寧動顆粒低劑量組；(6)寧動顆粒高劑量組；(7)天麻素組?？瞻讓φ战M腹腔注射生理鹽水5 ml/(kg·d)，其余6組腹腔注射Apo2.0 mg/(kg·d)。連續(xù)注射4周。Hal組給予氟哌啶醇1.0mg/

10、(kg.d))；NG+Hal組給予氟哌啶醇1.0mg/(kg·d)+寧動顆粒250mg/(kg·d)(相當(dāng)于臨床用量的10倍)；NGL組給予寧動顆粒250mg/(kg·d)(相當(dāng)于臨床用量的10倍)；NGH組給予寧動顆粒370mg/(kg·d)；Gas組給予天麻素20.0mg/(kg·d)；空白對照組及Apo組分別給予等量蒸餾水。各組大鼠均灌胃給藥，每日10：00am給藥1次，連續(xù)給藥12周。末次給藥后禁食24h，不禁水。3％戊巴比妥鈉

11、(30mg/kg，腹腔注射)麻醉，心臟取血分離血清，-20。C保存?zhèn)溆?。多聚甲醛全身灌注，留紋狀體固定備用，另取新鮮腦組織，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ缓筮M行后續(xù)實驗。
　　 2.研究內(nèi)容：(1)大鼠行為評分測定大鼠用藥后行為；(2)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中HVA含量；(3)ELISA法檢測紋狀體內(nèi)DA含量；(4)免疫組織化學(xué)染色法檢測紋狀體內(nèi)DRD

12、2蛋白表達；(5)RT-PCR法檢測紋狀體內(nèi)DRD2mRNA表達。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠行為研究
　　 與空白對照組比較，Apo可以顯著引起大鼠刻板活動。根據(jù)大鼠行為測定曲線圖所示，連續(xù)注射Apo4周后大鼠出現(xiàn)持續(xù)穩(wěn)定的刻板活動。給藥后Hal組、NG+Hal組和NGH組大鼠刻板活動與Apo組比較明顯減弱，且三組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Gas組大鼠刻板活動與Apo組比較明顯減弱，且與Hal組相比差異無統(tǒng)計學(xué)

13、意義NGL組刻板活動雖有所減弱，但與Apo組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與Hal組、NG+Hal組和NGH組相比有顯著性差異。
　　 2.血清中HVA含量比較
　　 與空白對照組比較，Apo組大鼠血清HVA含量明顯降低。各治療組大鼠血清HVA含量均有所升高，與Apo組相比差異具有顯著性，其中NG±Hal組升高最為顯著，其次為NGH組4治療組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 Gas組，與Hal組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　

14、 3.紋狀體中DA含量比較
　　 與空白對照組比較，Apo組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量明顯升高(103.42±44.39ng/ml vs240.23±72.32ng/ml，P＜0.01)。給藥后Hal組、NG+Hal組、NGL組和NGH組大鼠紋狀體內(nèi)DA含量均有所降低。NGH組紋狀體內(nèi)DA含量降低最顯著，與Apo組相比差異具有顯著性(136.04±50.95ng/ml vs240.23±72.32ng/ml，＜0.01)但Hal組、N

15、G+Hal組和NGL組DA含量與Apo組相比無顯著性差異(208.20±104.01ng/ml vs240.23±72.32ng/ml，P＞0.05；202.36±102.22ng/ml vs240.23±72.32ng/ml，P＞0.05；214.40±81.07ng/ml vs240.23±72.32ng/ml，P＞0.05)，三組間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，與NGH組比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 4

16、.大鼠腦組織切片紋狀體DRD2光鏡下DAB染色，灰度比較
　　 與空白對照組比較，Apo組大鼠紋狀體內(nèi)DRD2灰度明顯升高(P＜0.01)。給藥后Hal組、NG+Hal組、NGL組和NGH組大鼠紋狀體內(nèi)DRD2灰度均有所降低。NGH組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為Hal組和NG+Hal組，兩組與Apo比較均有顯著性差異(P＜0.05)，NGL組與Apo組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 NGL組和NGH組相比差異具有

17、顯著性(P＜0.01)。
　　 5.大鼠紋狀體內(nèi)DRD2 mRNA表達比較
　　 與空白對照組比較，Apo組大鼠紋狀體內(nèi)DRD2mRNA表達明顯升高(P＜0.01)。給藥后Hal組、NG+Hal組、NGL組和NGH組大鼠紋狀體內(nèi)DRD2mRNA表達均有所降低。NG+Hal組下降最為顯著(P＜0.01)，其次為Hal組和NGH組，兩組與Apo比較均有顯著性差異(P＜0.05)，Hal組、NG+Hal組和NGH組與NGL組相