PMQR基因及gyrA、parC基因突變與銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類耐藥之間關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　 1.了解廣州地區(qū)臨床分離銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)對(duì)常用抗菌藥物的耐藥狀況。
　　 2.明確廣州地區(qū)質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮耐藥(PMQR)基因在銅綠假單胞菌中的流行狀況并分析其與耐藥之間的關(guān)系。
　　 3.探討gyrA、parC基因突變與銅綠假單胞菌對(duì)喹諾酮類抗菌藥物耐藥之間的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.收集廣州地區(qū)2005-2007年間臨床分離的

2、銅綠假單胞菌，使用VITEK-32型微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)菌株重新鑒定；采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法按照CLSI抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，獲取耐藥信息。
　　 2.使用兩組多重PCR反應(yīng)對(duì)所有銅綠假單胞菌中的PMQR基因進(jìn)行檢測(cè)，一組檢測(cè)qnrA、qnrB、qnrS、qnrC和qnrD，另一組檢測(cè)aac(6')-Ib和qepA，設(shè)計(jì)針對(duì)各基因變異體共有區(qū)域的特異性引物并依照多重PCR的要求優(yōu)化反應(yīng)條件；多重PCR擴(kuò)增出目的片

3、段者使用相應(yīng)引物單獨(dú)進(jìn)行PCR，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)以確定其亞型。
　　 3.采用連續(xù)瓊脂擴(kuò)散法體外模擬4株銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥進(jìn)化過程；分別設(shè)計(jì)特異性引物，PCR擴(kuò)增所得菌株gyrA和parC的QRDR并測(cè)序分析有無(wú)突變、突變位點(diǎn)及由此導(dǎo)致的氨基酸改變；將誘導(dǎo)耐藥的銅綠假單胞菌無(wú)藥連續(xù)培養(yǎng)15代，K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定每一代細(xì)菌的抑菌圈直徑，PCR擴(kuò)增第15代銅綠假單胞菌gyrA和parC的QR

4、DR并測(cè)序，以觀察體外誘導(dǎo)耐藥的銅綠假單胞菌在表型及基因上的穩(wěn)定性；
　　 4.在14株臨床分離環(huán)丙沙星耐藥株中PCR擴(kuò)增gyrA和parC的QRDR，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分析，并與體外誘導(dǎo)耐藥株的突變進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)過重新鑒定，共得到212株銅綠假單胞菌，其中148株(69.8％)分離自痰標(biāo)本；藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，平均耐藥率超過30％的抗菌藥物有2種，分別是慶大霉素42.9％(91/212)和阿米

5、卡星33.0％(70/212)，環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的平均耐藥率分別是10.8％(23/212)和19.3％(41/212)，所有9種抗菌藥物的耐藥率均高于10％；2005-2007年間銅綠假單胞菌的多重耐藥率為26.4％(56/212)；環(huán)丙沙星和左氧氟沙星與慶大霉素、亞胺培南的共同耐藥率超過69％，而對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的菌株100％對(duì)左氧氟沙星耐藥。
　　 2.在212株銅綠假單胞菌中通過PCR擴(kuò)增及測(cè)序共有4株(1.9％)檢出

6、qnr基因，分別是qnrB陽(yáng)性2株(0.9％)，qnrS陽(yáng)性1株(0.5％)，aac(6')-Ib-cr陽(yáng)性2株(0.9％)，其中1株細(xì)菌同時(shí)檢出qnrB與aac(6')-Ib-cr基因，但是這4株細(xì)菌中僅有1株對(duì)左氧氟沙星表現(xiàn)為耐藥。其他質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因qnrA、qnrC、qnrD、qepA均未檢出。
　　 3.經(jīng)過15輪體外連續(xù)誘導(dǎo)4株銅假單胞菌均成為環(huán)丙沙星耐藥株，在該過程中4株細(xì)菌gyrA基因的QRDR均發(fā)生突變，突變

7、的氨基酸位點(diǎn)包括Ala67→Ser，Asp72→Gly，Gly75→Ala，Thr83→Ile，Asp87→Tyr，其中1株為雙突變，另外3株為單點(diǎn)突變；parC基因的QRDR均未發(fā)現(xiàn)突變；經(jīng)過15輪連續(xù)的無(wú)藥培養(yǎng)，4株耐藥銅綠假單胞菌對(duì)環(huán)丙沙星的耐藥性及基因突變均保持穩(wěn)定，無(wú)回復(fù)突變發(fā)生；對(duì)基因突變發(fā)生時(shí)間點(diǎn)的分析表明，銅綠假單胞菌在3代的誘導(dǎo)后即進(jìn)入中介區(qū)，在進(jìn)入中介區(qū)時(shí)即有突變發(fā)生，且隨著耐藥程度的加劇會(huì)發(fā)生第2個(gè)位點(diǎn)的突變。

8、r>　　 4.通過對(duì)14株臨床分離環(huán)丙沙星耐藥株gyrA與parC基因QRDR的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序發(fā)現(xiàn)，所有菌株的gyrA基因均發(fā)生單點(diǎn)突變，導(dǎo)致GyrA Thr83→Ile、Asp87→Tyr，其中有2株還同時(shí)發(fā)生parC基因單點(diǎn)突變，導(dǎo)致ParC Ser87→Leu；與體外誘導(dǎo)耐藥的銅綠假單胞菌相比，臨床分離耐藥株GyrA的突變位點(diǎn)較少，兩者均有GyrAThr83→Ile、Asp87→Tyr突變，而體外誘導(dǎo)耐藥株無(wú)parC突變發(fā)生