人參皂苷誘導(dǎo)人神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化的機(jī)制研究以及在缺血缺氧和蛛網(wǎng)膜下腔出血誘導(dǎo)的腦損傷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)干細(xì)胞因具有自我更新和多向分化的生物學(xué)特征，已成為組織細(xì)胞工程研究的基礎(chǔ)模型和移植治療神經(jīng)系統(tǒng)多種疾病的種子細(xì)胞，也為以往認(rèn)為不可能治愈的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的治療帶來了新的希望。神經(jīng)干細(xì)胞的研究已成為當(dāng)今生物學(xué)領(lǐng)域最熱門、最前沿、最具活力的課題之一。各國政府都在投入更大的人力、物力和財(cái)力，希望在此領(lǐng)域中獲得突破，掌握先機(jī)，為全球社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民的健康做出巨大貢獻(xiàn)。
　　 迄今為止，增殖和定向誘導(dǎo)分化

2、仍然是神經(jīng)干細(xì)胞研究的核心內(nèi)容之一。而國內(nèi)外的研究大多集中于細(xì)胞因子對NSCs的影響上，利用傳統(tǒng)中藥誘導(dǎo)NSCs的增殖分化研究甚少。人參是我國傳統(tǒng)名貴中藥，具有“補(bǔ)氣生血”的強(qiáng)大功效，人參皂苷Rg1是人參的主要藥效成分。藥理學(xué)研究表明，人參皂苷Rg1具有抗衰老、減少神經(jīng)細(xì)胞損傷、促進(jìn)腦功能恢復(fù)、促進(jìn)腦內(nèi)蛋白質(zhì)的合成、增加突觸數(shù)目、增強(qiáng)記憶等功效，但對NSCs誘導(dǎo)分化的研究較少，特別是利用基因芯片技術(shù)篩選出人參皂苷Rg1促進(jìn)NSCs分化的

3、主要分子靶點(diǎn)，通過分化細(xì)胞的電生理特性，研究其功能分化水平，更是未見報(bào)道。
　　 我們研究NSCs就是利用它結(jié)構(gòu)與功能的可塑性去治療神經(jīng)系統(tǒng)損傷及疾病。新生兒缺氧缺血性腦病患病率高達(dá)4‰，是導(dǎo)致腦永久性損傷，腦性癱瘓的重要原因，是臨床上難治性疾病。我們將人參皂苷Rg1誘導(dǎo)的NSCs應(yīng)用在缺血缺氧性新生模型鼠中，以進(jìn)一步從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明人參皂苷Rg1誘導(dǎo)的NSCs功能分化的效果以及應(yīng)用潛力。
　　 人參皂苷Rb1是人參另一重

4、要活性成分。現(xiàn)已證實(shí)Rb1在心腦血管系統(tǒng)的疾病治療中有重要的作用。例如阻滯心肌細(xì)胞的鈣超載，減輕缺血和/或缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞死亡，增加神經(jīng)元的可塑性等。蛛網(wǎng)膜下腔出血是一種老年人常見疾病，常伴有腦組織廣泛嚴(yán)重?fù)p傷和高死亡率、高致殘率，雖然全世界進(jìn)行了廣泛的研發(fā)，以尋找新的藥物和治療手段，但療效仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如人意。因此，我們也探討了人參皂苷Rb1對出血性腦損傷的治療作用，期望在更大程度上挖掘人參這一“百草之王”的重大藥用價(jià)值，為臨床治療新生

5、兒缺氧缺血性腦病和蛛網(wǎng)膜下腔出血提供新的理論與實(shí)驗(yàn)資料。
　　 方法：
　　 1.從7～12w流產(chǎn)人胚胎大腦皮層中分離NSCs，采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方法反復(fù)傳代培養(yǎng)，純化NSCs；經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)和免疫細(xì)胞化學(xué)對其鑒定；并觀察不同濃度的Rg1對NSCs增殖、分化的影響。
　　 2.通過基因芯片技術(shù)，觀察Rg1誘導(dǎo)人NSCs向神經(jīng)元分化7d時(shí)靶基因表達(dá)情況，通過圖形比對分析、Pathway分析、數(shù)據(jù)演算最終篩選出R

6、g1促進(jìn)NSCs分化的最主要的目的基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，再采用western blot和免疫組化的方法對篩選出的ERK靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 3.采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分析人參皂苷Rg1誘導(dǎo)人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化7d時(shí)，神經(jīng)元樣細(xì)胞的膜特性以及鈉、鉀離子通道的功能表達(dá)，通過電生理特性證實(shí)檢測細(xì)胞的功能成熟水平，以證實(shí)人參皂苷Rg1能促進(jìn)NSCs功能分化成熟。
　　 4.將人參皂苷Rg1誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞移植入缺血缺氧的新生鼠模型

7、側(cè)腦室，采用TTC染色和行為學(xué)觀察對模型進(jìn)行評價(jià)。通過水迷宮、體感誘發(fā)電位觀測其腦功能的恢復(fù)情況，免疫組化檢測移植的神經(jīng)干細(xì)胞生長、分化狀況。
　　 5.將人參皂苷GRb1應(yīng)用到蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠模型中，通過統(tǒng)計(jì)死亡率，檢測腦水含量、大腦基底動(dòng)脈的血管壁厚度和管腔面積，血腦屏障通透性，電鏡檢測血管壁的損傷情況，以及神經(jīng)功能學(xué)評分來客觀評價(jià)Rb1的治療效果。通過檢測腦神經(jīng)元凋亡情況和p53、caspase-3、Bax以及Bcl-

8、2等關(guān)鍵性凋亡通路相關(guān)蛋白的表達(dá)來探討GRb1作用的可能機(jī)理。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外一定濃度的Rg1有明顯的促進(jìn)NSCs增殖和分化的功效。
　　 ●Rg1濃度為120μg/ml時(shí)，MTT的OD值最大，促增殖效果最好。
　　 ●Rg1濃度為10μg/ml時(shí)，NSE、GFAP和Gal-c的細(xì)胞陽性率開始升高，20μg/ml時(shí)，分化的細(xì)胞達(dá)到高峰，并比IL-1組效果略好。但繼續(xù)再增加Rg1的濃度對提高分

9、化細(xì)胞的陽性率沒有幫助。
　　 2.基因芯片檢測和數(shù)據(jù)分析可以篩選出人參皂苷Rg1促進(jìn)NSCs增殖分化的主要靶基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　　 ●基因芯片共檢測到Rg1誘導(dǎo)NSCs分化過程中差異表達(dá)基因675個(gè)，其中顯著上調(diào)的基因有255個(gè)，顯著下調(diào)的基因有420個(gè)。
　　 ●基因種類主要有與細(xì)胞生物合成、細(xì)胞代謝、轉(zhuǎn)錄正向調(diào)控、中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞分化、離子通道活性等相關(guān)基因。分別占差異基因總數(shù)的21.6％、11.

10、7％、6.4％、5.1％、3.4％和1.5％。其中與NSCs分化相關(guān)最主要的上調(diào)基因有：syntaxin1基因，α-tubulin基因，下調(diào)基因有Wnt抑制因子-1。與調(diào)控離子通道相關(guān)的基因有：編碼受體門控性陽離子通道（ROC）蛋白的基因，編碼4型內(nèi)向整流K+通道的基因和編碼TRPm2通道蛋白的基因。
　　 ●通過Pathway分析發(fā)現(xiàn)，MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）通路中的ERK（細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶）在Rg1誘導(dǎo)NSCs分

11、化過程中扮演重要角色。而CAMP（環(huán)磷酸腺苷）-PKA（蛋白激酶A）和PI3K（磷脂酰肌醇-3激酶）-AKT信號傳導(dǎo)通路在Rg1促增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　 ●經(jīng)western blot和免疫組化檢測，Rg1誘導(dǎo)NSCs分化過程中，ERK1/2蛋白明顯上調(diào)，并且其磷酸化可以被Rg1激活，30min時(shí)達(dá)到高峰，60min時(shí)消失。在使用ERK阻斷劑PD98059后，NSCs的分化率明顯下降。得到與基因芯片相同的結(jié)果。
　　

12、 3.全細(xì)胞膜片鉗檢測證實(shí)，人參皂苷Rg1能促進(jìn)NSCs電生理特性的表達(dá)和功能分化成熟。
　　 人參皂苷Rg1（20μg/ml）誘導(dǎo)NSCs分化7天時(shí)
　　 ●神經(jīng)元樣細(xì)胞的膜靜息電位：45.70±2.63 mv；膜電容：26.89±1.91 pf；膜輸入阻抗：877.51±20.44 MΩ；均較對照組有明顯差異（P<0.05）。
　　 顯示了更為成熟的神經(jīng)元細(xì)胞膜特性。
　　 ●記錄到電壓依賴性的快速

13、激活、快速失活的內(nèi)向Na+電流，并可被TTX阻斷，其平均峰值為711.48±158.03pA，檢出率50％，對照組267.2±71.15pA，檢出率22％，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 ●記錄到電壓依賴性的外向K+電流（經(jīng)鑒定為快速激活的瞬時(shí)外向型K+電流和延遲整流型的外向K+電流），平均峰值1070.42±177.18pA，對照組：798.11±100.02pA，（P<0.05）。
　　 4.移植Rg1誘導(dǎo)后的NSCs，可以

14、在治療新生大鼠缺血缺氧性腦損傷中發(fā)揮較好的作用。
　　 移植Rg1誘導(dǎo)的人NSCs到的缺血缺氧模型大鼠體內(nèi)1月后：
　　 ●水迷宮實(shí)驗(yàn)潛伏期：60.38±13.5s，游泳路程：686.52±142.75 cm，較對照組明顯縮短；目標(biāo)象限探索時(shí)間：40.72±6.14s，較對照組明顯延長（P<0.05）。
　　 ●體感誘發(fā)電位實(shí)驗(yàn)潛伏期18.42±1.79ms，較對照組明顯縮短；振幅：227.28±19.38μv，

15、較對照組明顯增大（P<0.05）。
　　 ●抗人NSE抗體免疫組化染色顯示：移植組的腦切片中，分化的神經(jīng)元樣細(xì)胞在皮層呈散在表達(dá)，而在海馬區(qū)域呈集中表達(dá)并圍繞缺血損傷區(qū)域生長。
　　 5.人參皂苷Rb1對蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）的腦損傷有積極的治療和保護(hù)作用。
　　 20mg/kg Rb1治療SAH模型大鼠后：
　　 ●死亡率15.15％；假手術(shù)組6.67％，生理鹽水組24.32％。
　　 ●自發(fā)

16、活動(dòng)評分提高；
　　 ●腦水腫明顯降低；血腦屏障通透降低；
　　 ●血管內(nèi)皮細(xì)胞電鏡及光鏡組織病理學(xué)明顯改善；大腦基底動(dòng)脈管腔面積明顯增大而管壁厚度明顯降低；
　　 ●神經(jīng)元凋亡指數(shù)明顯減少。
　　 ●促凋亡蛋白p53，以及由p53激活的Bax蛋白和caspase-3蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.一定濃度的Rg1有明顯的促進(jìn)NSCs增殖和分化的

17、功效。
　　 2.通過基因芯片檢測可以篩選出Rg1促NSCs增殖、分化過程中的重要靶基因。其中與分化相關(guān)的主要基因是：syntaxin1基因，α-tubulin基因，WIF-1基因等；與離子通道調(diào)控相關(guān)的靶基因主要是：ROC基因，TRPm2基因，4型內(nèi)向整流K+通道基因等。而數(shù)據(jù)分析得出人參皂苷Rg1促進(jìn)NSCs增殖、分化的機(jī)制與CAMP-PKA、PI3K-AKT、ERK信號通路的激活有關(guān)。
　　 3.人參皂苷Rg1能促