穿膜肽介導(dǎo)的眼內(nèi)基因遞送系統(tǒng).pdf

1、眼內(nèi)新生血管性疾病是一類(lèi)眼部的高發(fā)病變，可引起包括老年黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫等致盲性眼部疾病。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)在眼內(nèi)新生血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，成為主要的治療靶點(diǎn)之一。目前臨床上采用整合素、單克隆抗體、適配體及干擾RNA等藥物拮抗VEGF，起到抑制新生血管形成的作用。這類(lèi)治療用生物大分子由于分子量大、親水性強(qiáng)，通過(guò)滴眼的方式給藥很難吸收到達(dá)

2、眼后段，必須采用玻璃體內(nèi)注射給藥，導(dǎo)致患者順應(yīng)性差。因此,如何改善此類(lèi)藥物通過(guò)非損傷途徑給藥的眼部吸收是藥劑學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一類(lèi)具有穿透細(xì)胞膜能力的短肽，一般由不超過(guò)30個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子整體帶正電荷。CPP以非受體依賴(lài)方式穿過(guò)細(xì)胞膜，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不易造成細(xì)胞損傷。目前常用的CPPs有TAT（轉(zhuǎn)錄蛋白反式作用子）、聚精氨酸、穿膜素（penet

3、ratin或transportan）等，利用這些CPPs已成功地將蛋白質(zhì)、核酸、納米粒、脂質(zhì)體等多種生物大分子或納米制劑遞送到細(xì)胞中。
　　本文旨在從目前研究較成熟的穿膜肽中篩選出一種眼部透過(guò)性及安全性良好的穿膜肽。并構(gòu)建一種CPPs介導(dǎo)的非損傷性眼部基因遞送系統(tǒng)，改善基因藥物經(jīng)由結(jié)膜囊內(nèi)給藥在眼后段的吸收，取代目前常用的玻璃體內(nèi)注射的給藥方法，提高患者順應(yīng)性，為實(shí)現(xiàn)生物活性大分子藥物的眼部遞送提供新途徑。
　　本文第一部分

4、針對(duì)Penetratin、Protamine、TAT、Poly(arginine)8四種備選穿膜肽及電中性的Poly(serine)8對(duì)照肽展開(kāi)了體內(nèi)外評(píng)價(jià)。采用結(jié)膜細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、家兔離體角膜透過(guò)性實(shí)驗(yàn)和大鼠在體結(jié)膜囊內(nèi)給藥觀測(cè)眼內(nèi)分布等一系列評(píng)價(jià)方法，系統(tǒng)地對(duì)CPPs的眼部透過(guò)性進(jìn)行研究。我們發(fā)現(xiàn)，在四種備選穿膜肽中，Penetratin具有最強(qiáng)的眼部透過(guò)性及安全性，細(xì)胞攝取量是對(duì)照肽Poly(serine)8的16～2

5、9倍，離體角膜表觀透過(guò)系數(shù)達(dá)到對(duì)照肽的87.5倍;結(jié)膜囊內(nèi)給藥能夠快速吸收，且在眼后段廣泛分布。采用圓二色譜對(duì)四種穿膜肽的構(gòu)象進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Penetratin的眼部透過(guò)性與其兩親性及獨(dú)特的脯氨酸二型螺旋構(gòu)型有關(guān)。此外，選取了與備選穿膜肽氨基酸序列相同的D構(gòu)型穿膜肽進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)換后穿膜肽的眼部透過(guò)性減弱，因而確定了L構(gòu)型的Penetratin作為下一步研究中采用的優(yōu)選穿膜肽分了。
　　本文第二部分采用紅色熒光蛋

6、白質(zhì)粒(pRFP)、低分子量分枝狀陽(yáng)離子聚合物（Low molecular weight Branched Cationic Polymer，LBCP)與穿膜肽Penetratin(P)設(shè)計(jì)并制備了兩種不同結(jié)構(gòu)的物理復(fù)合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P，采用靜電結(jié)合方式壓縮報(bào)告基因，并對(duì)其進(jìn)行了處方篩選、結(jié)構(gòu)確證和理化性狀表征。優(yōu)化得到兩種物理復(fù)合物的基本處方:復(fù)合物pRFP/P處方中Penetratin與pRFP的電荷比為20∶

7、1;復(fù)合物pRFP/LBCP/P中LBCP與pRFP的氮磷比為5∶1，Penetratin與pRFP的電荷比為20∶1。采用超濾離心法對(duì)復(fù)合物的形成進(jìn)行了驗(yàn)證。兩種復(fù)合物pRFP/P與pRFP/LBCP/P的粒徑分別在400nm和100～200 nm左右，其中PAMAM參與形成的處方粒徑小于其他各組，顯示出更強(qiáng)的基因壓縮效果和結(jié)合穿膜肽的能力。透射電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)各組物理復(fù)合物的外觀圓整均一，顆粒大小與粒徑測(cè)定結(jié)果相符。
　　本文

8、第三部分針對(duì)前文制備優(yōu)化得到的復(fù)合物處方進(jìn)行了體內(nèi)外多水平的系統(tǒng)評(píng)價(jià)，采用人結(jié)膜細(xì)胞與角膜細(xì)胞作為體外模型對(duì)各組復(fù)合物進(jìn)行了體外轉(zhuǎn)染效率的定性定量考察、細(xì)胞攝取機(jī)理探究等相關(guān)研究。篩選得到了用于眼部基因遞送的最優(yōu)處方:pRFP/P20及pRFP/PAMAM/P20+ PAMAM5。大鼠在體結(jié)膜囊內(nèi)給藥實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二者在眼內(nèi)均可達(dá)到較好的轉(zhuǎn)染效果。眼部藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明兩種復(fù)合物經(jīng)滴眼給藥可以快速吸收入眼，并且在眼后段滯留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8h以上。