細(xì)胞穿膜肽Scp01-b穿膜效率及其介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　細(xì)胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPPs)是一類新式非病毒基因載體。Scp01-b是結(jié)合課題組前期研究成果及最新研究進(jìn)展設(shè)計(jì)、合成一種新的細(xì)胞穿膜肽。本實(shí)驗(yàn)旨在研究細(xì)胞穿膜肽Scp01-b穿膜效率及檢測(cè)Scp01-b介導(dǎo)pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的效率，為更好地利用Scp01-b這一新型細(xì)胞穿膜肽遞送工具提供更多理論支持。
　　方法：
　　(1)從CPPs肽

2、庫中篩選并設(shè)計(jì)出實(shí)驗(yàn)所用肽序列，分別合成帶有熒光標(biāo)記的Scp01-b-FITC、NCO-FITC等短肽。將Scp01-b、NCO等與細(xì)胞體外共孵育，熒光標(biāo)記定位分析細(xì)胞內(nèi)熒光分布，熒光酶標(biāo)儀定量分析細(xì)胞內(nèi)的熒光量，并檢測(cè)Scp01-b在不同條件下細(xì)胞內(nèi)熒光量的變化。
　　(2)通過紅細(xì)胞裂解實(shí)驗(yàn)、乳酸脫氫酶（LDH）釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Scp01-b對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響，通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Scp01-b對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
　　(3)

3、按照肽-質(zhì)粒不同的氮-磷比值，使一定量肽與pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒混合并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并檢測(cè)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　(1)不同濃度的Scp01-b均能穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，且分布于胞漿與胞核，細(xì)胞內(nèi)熒光量隨著濃度增加而增多。
　?。?）Scp01-b穿膜效率在一定時(shí)間范圍內(nèi)（0.5 h-2.0 h），細(xì)胞內(nèi)熒光量隨著隨著時(shí)間延長而增多。
　　（3）Scp01-b的穿膜作用沒有細(xì)胞選擇特異性，

4、且Scp01-b穿膜效率受到多種因素影響，10％DMSO可以明顯提高Scp01-b的穿膜效率，0.6M蔗糖、葡萄糖對(duì)Scp01-b的穿膜效率提高不明顯；低溫可以抑制Scp01-b的穿膜效率；Scp01-b的穿膜作用對(duì)細(xì)胞膜完整性及細(xì)胞活性沒有明顯影響。
　　4、血清的存在可以抑制Scp01-b的穿膜效率，CPPs穿膜抑制劑肝素、MβCD可以抑制Scp01-b的穿膜效率，而NaN3、NH4Cl對(duì)Scp01-b的穿膜效率抑制不顯著。<