刺參池塘養(yǎng)殖環(huán)境中幾類細(xì)菌的周年變化規(guī)律及快速檢測方法研究.pdf

1、隨著刺參(Apostichopus japonicus)人工養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,刺參病害日漸突出。微生物是刺參養(yǎng)殖池塘生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分,理化參數(shù)也與刺參的健康狀況息息相關(guān)。因此,研究刺參養(yǎng)殖池塘中可培養(yǎng)細(xì)菌的周年變化規(guī)律及其與理化參數(shù)的關(guān)系,對刺參健康養(yǎng)殖具有重要意義。另外,快速定量檢測環(huán)境中刺參病原菌的數(shù)量變化,也有助于對刺參疾病的發(fā)生進(jìn)行預(yù)警,以便及時采取防治措施。本論文通過定期采樣檢測幾類可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量和理化指標(biāo),研究了刺參

2、養(yǎng)殖池塘水體和沉積物細(xì)菌的周年變化規(guī)律及其與理化環(huán)境因子的相關(guān)性,并建立了沉積環(huán)境中2種主要致病菌的快速檢測方法,主要內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.本研究于2012年4月至2013年4月,對山東省即墨刺參養(yǎng)殖池塘水體中4種可培養(yǎng)細(xì)菌(總異養(yǎng)菌、弧菌、硝化細(xì)菌、硫化細(xì)菌)、4項理化參數(shù)(溫度、pH、鹽度、溶解氧)和沉積環(huán)境中的6種可培養(yǎng)細(xì)菌(總異養(yǎng)菌、弧菌、硝化細(xì)菌、硝酸鹽還原菌、硫化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌)、6項理化參數(shù)(溫度、pH、氧化

3、還原電位、硫化物、有機碳、總氮)的動態(tài)變化進(jìn)行了監(jiān)測;并分析了不同細(xì)菌類群之間及其與理化指標(biāo)間的相關(guān)性。結(jié)果顯示:水體中可培養(yǎng)總異養(yǎng)菌、弧菌的變化范圍分別為:7.10×102 cfu/mL~5.80×103 cfu/mL和1.00×101 cfu/mL~3.60×102 cfu/mL,硝化細(xì)菌和硫化細(xì)菌的變化范圍分別為:1.08×102 cfu/mL~6.09×104cfu/mL和1.25×101 cfu/mL~5.11×103 cfu

4、/mL,細(xì)菌數(shù)量的變化趨勢與水體溫度的變化趨勢一致。沉積物中總異養(yǎng)菌、弧菌、硝化細(xì)菌、硝酸鹽還原菌、硫化細(xì)菌和硫酸鹽還原菌變化范圍分別為:1.16×104 cfu/g~9.62×104 cfu/g,1.16×102 cfu/g~9.01×103 cfu/g,4.20×103 cfu/g~7.48×104 cfu/g,4.80×103cfu/g~5.85×104 cfu/g,5.50×102 cfu/g~4.45×103 cfu/g和9.

5、30×101 cfu/g~8.38×102 cfu/g。水體的pH、鹽度、溶解氧的變化范圍分別為:7.35~8.31,30.5~37.6,5.7~9.31 mg/L。沉積物的pH、氧化還原電位、硫化物的變化范圍分別為:7.10~7.61,-42.18~-65.06 mV,36.9~89.7 mg/kg。
　　理化參數(shù)和微生物數(shù)量間進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:刺參養(yǎng)殖池塘水體溫度與溶解氧呈極顯著負(fù)相關(guān),與水體中的總異養(yǎng)菌、弧菌、硝化細(xì)

6、菌、硫化細(xì)菌均呈極顯著正相關(guān);水體pH與鹽度呈顯著正相關(guān),水體溶解氧與總異養(yǎng)菌呈顯著負(fù)相關(guān)。刺參養(yǎng)殖池塘沉積物的pH和氧化還原電位呈顯著正相關(guān)、二者和硫化物含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)。硫化物含量與總異養(yǎng)菌、硫酸鹽還原菌和硝化細(xì)菌均呈極顯著正相關(guān),與硫化細(xì)菌和硝酸鹽還原菌呈顯著負(fù)相關(guān)性,總氮含量和硝化細(xì)菌正相關(guān)性顯著。各類細(xì)菌數(shù)量之間也存在一定的相關(guān)性:總異養(yǎng)菌與硝化細(xì)菌、硫酸鹽還原菌之間、硝化細(xì)菌與硫酸鹽還原菌均存在極顯著正相關(guān)性,弧菌與總異

7、養(yǎng)菌、硝化細(xì)菌之間存在正相關(guān)性,硝酸鹽還原菌與硝化細(xì)菌之間、硫酸鹽還原菌與硫化細(xì)菌之間存在負(fù)相關(guān)性。
　　2.利用 GyrB基因的特異性引物建立沉積環(huán)境中氣單胞菌屬細(xì)菌的實時熒光定量 PCR檢測方法。將已知濃度的氣單胞菌菌液加入滅菌的沉積物樣品中,作為模擬沉積物樣品。通過選擇和優(yōu)化沉積物DNA提取方法、特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)曲線模板,建立沉積環(huán)境中氣單胞菌屬細(xì)菌準(zhǔn)確檢驗的實時熒光定量 PCR方法,同時驗證該方法的特異性、靈敏性、重復(fù)性。

8、結(jié)果表明:采用改進(jìn)的溶菌酶-SDS溫和裂解法提取沉積物DNA,以擴(kuò)增GyrB基因片段的IAF和IAR為特異性引物,并直接以模擬沉積物樣品DNA為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以建立適用于定量檢測沉積環(huán)境中氣單胞菌屬細(xì)菌的實時熒光定量 PCR方法。該方法可靈敏、特異、準(zhǔn)確地定量檢測刺參養(yǎng)殖池塘底泥中檢測出氣單胞菌屬中不同種的細(xì)菌,檢出效率可達(dá)103 cfu/g。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)變異系數(shù)在0.21~0.80％,均小于5%,表明重復(fù)性良好。
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