四硫鉬酸鹽誘導(dǎo)的適度銅缺乏對(duì)大鼠血管球囊損傷反應(yīng)的影響.pdf

1、研究背景與目的:從球囊擴(kuò)張到藥物支架，冠心病的治療經(jīng)歷了里程碑式的發(fā)展，但再狹窄的防治仍然是困擾臨床醫(yī)生的一個(gè)課題。藥物洗脫支架在這方面顯示出良好的效果，但要預(yù)言其在治療各種斑塊類型中的療效似乎還為時(shí)尚早。隨著這類支架的使用增多，相關(guān)的并發(fā)癥報(bào)道也增多起來(lái)，如亞急性和晚期血栓形成以及由于血管毒性作用所致的動(dòng)脈瘤形成等。多支血管病變時(shí)，藥物支架的費(fèi)用也難以承受。因此，尋找一種安全有效、使用簡(jiǎn)便、并能長(zhǎng)久解決再狹窄的方法仍是有必要的?？诜?/p>

2、物或許是一種可選擇的治療策略。 近年來(lái)對(duì)再狹窄機(jī)制的研究表明，炎癥反應(yīng)在新內(nèi)膜形成過(guò)程中起著重要作用。激活的血小板和浸潤(rùn)的白細(xì)胞在血管損傷部位釋放出大量細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子和多種蛋白酶等，啟動(dòng)了一系列的反應(yīng)導(dǎo)致血管SMC增殖和遷移，血管新內(nèi)膜形成和管腔狹窄。核因子κB(NF-κB)的活化是參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟。因此部分學(xué)者認(rèn)為，抑制NF-κB的激活可以作為防治介入術(shù)后血管炎癥反應(yīng)和再狹窄的一種策略。

3、 四硫鉬酸鹽(tetrathiomolybdate，MOS42-，TM)是一種銅鰲合劑，通過(guò)口服可有效的與腸道和血漿中的銅及蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，使之被清除，從而降低血銅含量。銅是人體一種必需的營(yíng)養(yǎng)元素，它存在于人體的所有細(xì)胞和組織中，參與多種重要的代謝活動(dòng)，是多種蛋白酶、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB發(fā)揮功能的必需成分。銅是血管形成與分化的有力誘導(dǎo)劑，且可以促進(jìn)動(dòng)脈損傷反應(yīng)引起的再狹窄。TM銅鰲合作用使血銅降低具有抗炎、抗

4、纖維化和抗血管形成作用，在腫瘤的臨床治療實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果，TM可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞NF-κB的激活抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。并且TM通過(guò)口服作用于全身，安全有效，副作用少，主要是使用過(guò)量導(dǎo)致的貧血和/或白細(xì)胞減少，減少用藥量或停藥后即可恢復(fù)。人體能夠長(zhǎng)期耐受由TM誘導(dǎo)的Cp降低至基礎(chǔ)水平20％的顯著銅缺乏。 TM在心血管疾病方面的應(yīng)用研究?jī)H有少數(shù)報(bào)道，本課題研究TM誘導(dǎo)的銅缺乏對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后NF-κB活性的影響，及iN

5、OS、COX-2、基質(zhì)金屬蛋白酶和黏附因子等由NF-κB調(diào)控基因表達(dá)的因子的影響，探討TM誘導(dǎo)的銅缺乏對(duì)血管損傷后再狹窄的影響及可能的部分機(jī)制，國(guó)內(nèi)外尚無(wú)類似研究。 方法:本研究通過(guò)SD大鼠頸動(dòng)脈球囊剝脫術(shù)建立血管損傷和再狹窄模型。大鼠隨機(jī)分組，TM20組給予TM強(qiáng)飼，使血清銅藍(lán)蛋白(Cp)水平在術(shù)前下降到正常值的(20±5)％，并維持到術(shù)后取材時(shí)；TM50組使Cp水平于術(shù)前下降到正常值的(50±5)％，并維持到術(shù)后取材；對(duì)照組

6、給予蒸餾水強(qiáng)飼，術(shù)后于不同時(shí)點(diǎn)取材。采用HE染色光鏡觀察血管內(nèi)膜增生情況；電泳流動(dòng)漂移技術(shù)(eletrophoreticmobilityshiftassayEMSA)法測(cè)定NF-κB活性激活情況；免疫印記法(WesternBlot)檢測(cè)血管組織iNOS、COX-2的蛋白表達(dá)；采用明膠酶譜法檢測(cè)MMP-2和MMP-9的活性，免疫印記法檢測(cè)MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的蛋白表達(dá)；免疫印記法檢測(cè)VCAM-1蛋白表達(dá)。觀察

7、TM對(duì)上訴各指標(biāo)的影響，探討TM誘導(dǎo)的銅缺乏對(duì)血管損傷后再狹窄的影響及可能的機(jī)制。 結(jié)果: (一)TM治療對(duì)血管損傷后內(nèi)膜增生的影響HE染色可見(jiàn)對(duì)照組大鼠頸動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后14d及28d內(nèi)血管內(nèi)膜顯著增厚，血管強(qiáng)狹窄；TM鰲合治療使大鼠血銅降低到正常水平的20％時(shí)，可顯著抑制新生內(nèi)膜的形成，血管腔無(wú)明顯再狹窄。 (二)TM對(duì)NF-κB活性的影響對(duì)照組大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后6h，NF-κB活性即顯著升高達(dá)2.7倍；術(shù)

8、后1dNF-κB活性略下降；術(shù)后3d～5d，NF-κB活性逐漸恢復(fù)到接近術(shù)前水平。TM20組頸動(dòng)脈球囊損傷后6h，NF-κB活性也略有升高，為基礎(chǔ)值的1.4倍，但較對(duì)照組活性顯著降低，術(shù)后1d其活性就下降到接近正常，較對(duì)照組恢復(fù)更快。 (三)TM對(duì)iNOS和COX-2表達(dá)的影響對(duì)照組血管損傷后14d可檢測(cè)到iNOS和COX-2的顯著表達(dá)，TM誘導(dǎo)大鼠血清Cp下降到基礎(chǔ)水平的50％時(shí)，即可抑制iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)；Cp降

9、低到基礎(chǔ)值的20％時(shí)，iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)被顯著抑制。 (四)TM對(duì)MMP-2/-9和TIMP-1/-2表達(dá)的影響1.未損傷的大鼠頸動(dòng)脈組織MMP-2僅有少量活性形式，MMP-9無(wú)活性表達(dá)。對(duì)照組血管損傷后1d，MMP-9活性迅速提高，并持續(xù)到損傷后7d；MMP-2的活性在損傷后7～14d達(dá)到高峰，并在損傷后28d時(shí)仍維持在較高水平。TM20組MMP-9和MMP-2的活性均被顯著抑制，活性峰值明顯減低，且損傷后28d時(shí)

10、MMP-2活性已基本恢復(fù)到正常。 2.對(duì)照組MMP-2/-9的蛋白表達(dá)與其活性變化一致，TM20組MMP-2/-9的蛋白表達(dá)水平顯著降低。 3.術(shù)后14d，TM50組MMP-2蛋白表達(dá)水平也較對(duì)照組降低，但高于TM20組蛋白表達(dá)水平。 4.TIMP-1/-2的蛋白水平在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后1～3d較術(shù)前有所下降，隨后很快恢復(fù)到術(shù)前水平。TM20組TIMP-1/-2的蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組無(wú)明顯差別。 (五)

11、TM對(duì)VCAM-1蛋白表達(dá)水平的影響VCAM-1在球囊損傷后14d的大鼠頸動(dòng)脈組織有顯著表達(dá)，TM20組VCAM-1表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低。 結(jié)論: 1.TM鰲合血清銅，使銅水平降低到基礎(chǔ)值的20％時(shí)能夠顯著抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后的內(nèi)膜增生反應(yīng)，減輕血管腔狹窄。 2.TM誘導(dǎo)的銅缺乏能夠顯著抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后NF-κB的短暫激活，并使其更快恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。這可能是TM治療抑制再狹窄的機(jī)制之一。

12、3.TM誘導(dǎo)的銅缺乏能夠抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)，這可能是通過(guò)抑制由NF-κB的激活實(shí)現(xiàn)的。并且這種抑制作用與TM使用劑量相關(guān)。 4.血管損傷可激活MMP-2/-9的活性與表達(dá)，MMP-9主要作用于血管損傷早期，MMP-2的作用持續(xù)于整個(gè)損傷修復(fù)期，尤其在晚期更獨(dú)立發(fā)揮作用。 5.TM誘導(dǎo)的大鼠銅缺乏能夠有效抑制MMP-2和-9的活性與表達(dá)，MMP-2和-9基因表達(dá)NF-κB調(diào)控，TM對(duì)MM

13、P-2/-9的抑制的部分機(jī)制可能是通過(guò)抑制NF-κB激活產(chǎn)生的。 6.TM誘導(dǎo)的銅缺乏的對(duì)MMP-2表達(dá)的抑制是劑量依賴性的。 7.銅缺乏對(duì)血管MMPs的抑制因子TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)無(wú)明顯影響。 8.TM誘導(dǎo)的銅缺乏通過(guò)抑制MMP-2和-9的活性和表達(dá)，而不影響TIMP-1和-2的表達(dá)，從而抑制血管損傷后SMC的遷移和增殖，以及ECM的積累可能是TM抑制新生內(nèi)膜形成的機(jī)制之一。 9.TM誘導(dǎo)的