中山地區(qū)G6PD缺乏癥的分子流行病學調查及與腸道病毒71型手足口病的相關性研究.pdf

1、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥(Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD deficiency)是一種常見的X染色體連鎖不完全顯性遺傳病，在全球范圍內G6PD缺乏癥的患者有近4億人，約4.9％的人受累?，F(xiàn)普遍認為此病與瘧疾的自然選擇有關，主要分布在瘧疾曾一度流行的赤道附近熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國，這一遺傳性疾病主要分布在我國長江以南地區(qū)，呈“南高北低”的趨勢，男性發(fā)病率高于女性。廣

2、東省是G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，全省發(fā)病率約為3.1％～16.1％。上世紀的研究發(fā)現(xiàn)G6PD缺乏癥是由基因突變所致。全球至今共報道186種G6PD基因突變類型，在中國人群中發(fā)現(xiàn)28種，其中1376G＞T、1388G＞A和95A＞G是我國常見的三種突變，且僅在華人中存在。作為G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，我市至今尚未見G6PD缺乏癥基因頻率、基因突變譜及突變基因構成比等遺傳學資料的研究。G6PD廣泛存在于人類體細胞內，是磷酸戊糖途徑的關鍵酶，通過

3、提供還原型輔酶Ⅱ(Nitrate Reductase，NADPH)，使氧化型谷胱甘肽(Glutathione Disulfide，GSSG)轉化為還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH），保護細胞免受氧化損害。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足，細胞中GSH含量降低，導致機體抗氧化能力不足。病毒感染可誘導宿主細胞出現(xiàn)氧化應激（Oxidative Stress），導致細胞結構損傷和功能障礙[2-6]。研究發(fā)現(xiàn)，有限的抗氧化能力使

4、G6PD缺陷細胞對病毒的易感性增高，病毒感染G6PD缺陷細胞后會引起明顯的氧化應激，該作用導致病毒毒力增強，宿主細胞發(fā)生明顯的病理改變[7-9]。腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病(Hand，F(xiàn)oot and Mouth Disease，HFMD)的主要病原體之一，與手足口病患兒嚴重的神經系統(tǒng)并發(fā)癥密切相關。從以上研究出發(fā)，我們推測G6PD缺乏癥可能與EV71型手足口病有著密切關系，并可能通過氧化

5、應激途徑影響EV71的易感性及致病性。本研究分為兩個部分：
　　 第一部分：中山地區(qū)G6PD缺乏癥的分子流行病學調查。
　　 目的：G6PD缺乏癥是廣東省出生缺陷干預工程的五大病種之一，G6PD缺乏癥是中山市新生兒疾病篩查的病種之一，于1998年在我市開展，隨著篩查技術及篩查網(wǎng)絡的不斷完善，每年會檢出數(shù)千名G6PD缺乏癥患兒，作為G6PD缺乏癥的高發(fā)區(qū)，我市至今尚未見G6PD缺乏癥基因頻率、基因突變譜及突變基因構成比等遺

6、傳學資料的研究，本課題的開展將填補中山地區(qū)在這方面的空白，揭示G6PD缺乏癥在本地區(qū)的分子流行病學特征。
　　 方法：在上世紀80年代，杜傳書進行了大規(guī)模的G6PD缺乏癥流行病學調查，結果顯示全國G6PD缺乏癥基因頻率為0～44.83％，其中廣東漢族為7.89％，廣東省總發(fā)病率為5.4％。通過以下公式n=[uα/2/arcsin(δ/√p(1-p))]2，P=0.054，允許誤差δ=0.01，α=0.05，進行樣本量估計，至少需

7、要1961例。根據(jù)中山市政府2009年公布的中山市24個行政區(qū)（18個鎮(zhèn)區(qū)和6個街道）的人口比例，在2009年6月至2010年2月到我院接受婚前檢查的5940例中山市戶籍育齡人員中，按行政區(qū)人口比例進行分層隨機抽樣，共抽取樣本4105例，其中男性2119例，女性1986例，被檢者就診時均無貧血表現(xiàn)，所有研究對象均在我院的婚檢篩查系統(tǒng)建立個人檔案，課題全程采用電子化信息管理。本研究建立了從表型到基因型的分子鑒定流程，用Victor2-14

8、20型多標記分析儀定量檢測樣品中G6PD活性，成人G6PD活性＜1300U/L則為陽性，對陽性樣品用酚-氯仿法提取基因組DNA，經PCR擴增后利用變性高效液相色譜(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)技術進行分析，經DHPLC技術未檢測出已知基因突變且表型陽性的樣品被送去上海英駿生物技術有限公司進行G6PD基因測序。
　　 結果：本次流行病學調查共檢出G6

9、PD缺乏者195例，其中男性134例，男性檢出率為6.32％，女性61例，女性檢出率為3.07％，總檢出率為4.75％，男性和女性的G6PD缺乏癥檢出率有顯著差異(X2=23.97，P＜0.001)，男性高于女性，根據(jù)Hardy-Weinbeng定律，X連鎖疾病人群發(fā)病率等于男性患者頻率，中山市G6PD缺乏癥基因頻率為6.32％。我們從以上195例樣品中鑒定出191例有基因突變，4例表型陽性樣品未檢出突變，其中173例通過DHPLC分析

10、，18例通過基因測序，共檢出10種變異類型，分別為1388G＞A、1376G＞T、95A＞G、871G＞A、1311C＞T、1024C＞T、517C＞T、592C＞T、392G＞T、196T＞A，其中1376G＞T,1388G＞A以及95A＞G共占76.92％，本次在中山地區(qū)發(fā)現(xiàn)的517C＞T、196 T＞A均為廣東地區(qū)首次報道。從本次調查中我們還發(fā)現(xiàn)，1388G＞A、1376G＞T和95A＞G這三種基因突變對應G6PD酶的活性水平無顯

11、著差異，但半合子的G6PD酶活性明顯低于雜合子。
　　 結論：通過本次流行病學調查，闡明了中山戶籍人群G6PD缺乏癥的發(fā)病率、基因突變譜及表型與基因型的關系，為制訂該地區(qū)G6PD缺乏癥的防控計劃提供科學的參考依據(jù)，對優(yōu)生優(yōu)育、提高人口素質有重要意義。
　　 第二部分：G6PD缺乏癥與腸道病毒71型手足口病的相關性研究。
　　 目的：腸道病毒71型(Enterovirus71，EV71)是引起嬰幼兒手足口病的主要病

12、原體之一，與重癥手足口病密切相關。病毒感染機體后可誘導宿主細胞氧化應激并進一步加重感染。G6PD缺乏可造成NADPH生成不足，細胞中GSH含量降低，機體抗氧化能力不足。近年來已有研究發(fā)現(xiàn)G6PD缺陷細胞對EV71易感，我們推測G6PD缺乏癥可能與EV71感染所致手足口病有著密切關系。目前G6PD缺陷與EV71型手足口病關系的研究報道尚少，本次研究旨在探討G6PD缺陷對手足口病患兒EV71病毒易感性、感染后病情嚴重程度的影響，闡明G6PD

13、缺乏癥與EV71型手足口病之間的關系。
　　 方法：鑒于目前常見的G6PD活性檢測方法對男性缺乏者敏感，對女性缺乏者存在明顯的漏檢，故本次研究以男性兒童為研究對象。選取2011年6月至2012年10月我院收治的手足口病男性患兒220例為研究對象，其中145例為普通手足口?。ㄆ胀ńM），75例為重癥手足口?。ㄖ匕Y組）。手足口病診斷標準參照我國衛(wèi)生部2010年4月21日發(fā)布的《手足口病診療指南（2010年版）》。本研究的納入標準為同時

14、滿足以下3個條件:①符合手足口病的診斷標準;②經我院實驗室檢測大便病原學診斷為EV71感染;③病程少于5天。排除標準為以下任一項者:①近3個月內曾輸血、溶血;②家長拒絕行G6PD活性、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)檢測。對照組同期在我院體檢的132例健康男性兒童。所有研究對象在收住院后24小時內及手足口病恢復期分別采集靜脈血用于檢測血液中G6PD、GSH及MDA水平。根據(jù)急性期G6PD活性測定結果，

15、普通組與重癥組分別分為普通（G6PD正常）組、普通（G6PD缺乏）組、重癥（G6PD正常）組與重癥（G6PD缺乏）組。220例患兒均按照《指南》給予治療，觀察記錄重癥組患兒的總熱程、精神異常時間、肢體抖動持續(xù)時間、病理征持續(xù)時間及住院天數(shù)。
　　 結果：⑴對照組、普通組、重癥組中G6PD缺陷者分別為4例、15例、17例，所占比例分別為3.0％、10.34％、22.67％，普通組、重癥組G6PD缺陷率均較對照組高（均P＜0.05）

16、。⑵重癥（G6PD缺乏）組患兒總熱程為6.35±2.15天，精神異常天數(shù)為2.65±0.93天，肢體抖動持續(xù)天數(shù)為3.09±1.03天，病理征持續(xù)時間為1.18±0.53天，住院天數(shù)為10.59±2.32天，G6PD活性為524.26±450.61U/L;重癥（G6PD正常）組患兒總熱程為5.37±1.36天，精神異常天數(shù)為1.81±1.62天，肢體抖動持續(xù)天數(shù)為2.41±1.19天，病理征持續(xù)時間為0.66±0.86天，住院天數(shù)為8.

17、74±3.04天，G6PD活性為2842.67±665.64U/L。G6PD缺陷患兒總熱程、精神異常天數(shù)、肢體抖動持續(xù)天數(shù)、病理征持續(xù)天數(shù)及住院天數(shù)均顯著長于G6PD正常者(P＜0.05)，G6PD缺乏癥患兒G6PD活性較G6PD活性正常者顯著降低(P＜0.001)。⑶普通組急性期全血GSH含量為2.70±0.98mg/gHb，血清MDA為3.80±1.10umol/L，G6PD活性為2963.06±988.36 U/L;重癥組急性期全

18、血GSH含量為2.28±1.51mg/gHb，血清MDA為4.19±1.08umol/L，G6PD活性為2317.16±1157.63U/L;對照組全血GSH含量為3.63±0.65mg/gHb，血清MDA為3.41±0.52umol/L，G6PD活性為3260.26±701.83U/L。急性期普通組和重癥組的GSH、G6PD水平均顯著低于對照組，MDA水平均顯著高于對照組(P＜0.05);重癥組的GSH、G6PD水平均顯著低于普通組，

19、MDA水平顯著高于普通組(P＜0.05)。普通組恢復期全血GSH含量為2.63±0.83mg/gHb，血清MDA為3.76±1.09umol/L，G6PD活性為2984.11±972.82 U/L;重癥組恢復期全血GSH含量為2.41±0.91mg/gHb，血清MDA為3.99±0.91umol/L，G6PD活性為2324.77±1148.04U/L。恢復期普通組與重癥組GSH、G6PD水平均比對照組低(P＜0.05)，MDA水平均較對

20、照組高(P＜0.05);普通組與重癥組恢復期GSH、MDA水平比較均無顯著差異(P＞0.05)，普通組G6PD水平仍顯著高于重癥組(P＜0.05)。⑷普通(G6PD正常)組急性期的全血GSH為2.92±0.76mg/gHb，血清MDA為3.62±1.01 umol/L，G6PD活性為3242.85±549.26U/L;普通(G6PD正常)組恢復期的全血GSH為2.81±0.48mg/gHb，血清MDA為3.71±1.57 umol/L，

21、G6PD活性為3265.18±574.45 U/L;普通(G6PD缺乏)組急性期的全血GSH為0.77±0.12mg/gHb，血清MDA為5.37±0.41umol/L，G6PD活性為538.22±490.94U/L;普通(G6PD缺乏)組恢復期的全血GSH為1.08±0.20mg/gHb，血清MDA為4.14±1.19umol/L，G6PD活性為548.18±484.10U/L;重癥(G6PD正常)組急性期的全血GSH為2.75±0.

22、84mg/gHb，血清MDA為3.80±0.84umol/L，G6PD活性為2842.67±665.64 U/L;重癥(G6PD正常)組恢復期的全血GSH為2.78±0.78mg/gHb，血清MDA為3.92±1.14umol/L，G6PD活性為2849.58±665.91U/L;重癥(G6PD缺乏)組急性期的全血GSH為0.67±0.13mg/gHb，血清MDA為5.53±0.67umol/L，G6PD活性為524.26±450.61

23、U/L;重癥(G6PD缺乏)組恢復期的全血GSH為1.16±0.26mg/gHb，血清MDA為4.24±1.00umol/L，G6PD活性為534.26±440.35U/L。急性期及恢復期普通（G6PD正常）組GSH水平均較普通（G6PD缺乏）組高(P＜0.01)，重癥（G6PD正常）組GSH水平均較重癥（G6PD缺乏）組高(P＜0.01)。急性期普通（G6PD正常）組MDA水平較普通（G6PD缺乏）組低(P＜0.01)，重癥（G6PD

24、正常）組MDA水平較重癥（G6PD缺乏）組低(P＜0.01)。在恢復期，普通（G6PD正常）組與普通(G6PD缺乏)組、重癥（G6PD正常）組與重癥（G6PD缺乏）組MDA水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。普通（G6PD正常）組、重癥（G6PD正常）組急性期與恢復期GSH、MDA水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），普通(G6PD缺乏)、重癥（G6PD缺乏）組恢復期GSH水平均較急性期高(P＜0.01)，恢復期MDA水平

25、均較急性期低(P＜0.01)。以上四組急性期與恢復期G6PD水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。⑸急性期普通組GSH水平與G6PD活性呈正相關（r=0.63，P＜0.001），MDA與G6PD活性呈負相關(r=-0.51，P＜0.001)。急性期重癥組GSH水平與G6PD活性呈正相關（r=0.53，P＜0.001），MDA與G6PD活性呈負相關（r=-0.57，P＜0.001）?；謴推谄胀ńMGSH水平與G6PD活性呈正相關（r=

26、0.65，P＜0.001），重癥組GSH水平與G6PD活性呈正相關（r=0.48，P＜0.001），普通組和重癥組MDA與G6PD活性均無相關性(P＞0.05)。
　　 結論：從研究結果可知普通組、重癥組G6PD缺陷者所占比例均高于對照組，提示G6PD缺乏可能增加機體對EV71的易感性。本研究中，急性期普通組與重癥組GSH、G6PD水平比對照組低，MDA水平較對照組高，提示在EV71感染急性期，機體確實存在氧化應激。進一步分析發(fā)

27、現(xiàn)，手足口病患兒GSH、MDA水平均受G6PD活性影響，GSH水平與G6PD活性呈正相關，MDA水平與G6PD活性呈負相關，以上結果提示G6PD缺陷者在EV71感染急性期，由于抗氧化能力不足，可能會出現(xiàn)高水平氧化應激，加重氧化應激損傷。本研究還發(fā)現(xiàn)重癥組中G6PD缺陷者病情好轉需時及住院時間均較G6PD活性正常者長，提示機體氧化應激的程度與患兒病情相符。本研究中，G6PD缺陷患兒恢復期GSH水平較急性期增高，MDA水平較急性期降低，且恢

28、復期GSH水平與G6PD活性呈正相關，MDA水平與G6PD活性無相關性，以上結果提示G6PD缺陷患兒進入手足口病恢復期后，隨著氧化應激損傷的減輕，患兒的病情可能隨之好轉。手足口病患兒急性期與恢復期G6PD水平比較均無顯著差異，說明說明G6PD缺陷不因EV71感染而改變，G6PD活性不受EV71感染影響。EV71感染引起重癥手足口病的致病機制十分復雜，目前尚未清楚，本次研究結果在臨床上提示機體氧化應激反應可能是機制之一。廣東省于1989年

29、開始在新生兒中逐步開展G6PD缺乏癥篩查，2003年廣東省衛(wèi)生廳制定了《廣東省新生兒疾病篩查管理辦法》（試行），明確指出G6PD缺乏癥為廣東省新生兒疾病篩查的病種之一。鑒于本次研究結果，對確診為G6PD缺乏癥的患兒，除了告知避免接觸誘發(fā)溶血的物質，還需告知其對病毒易感，在手足口病流行季節(jié)注意加強防護。檢測手足口病患兒G6PD活性，確定其是否存在G6PD缺陷，有助于評估患兒病情轉歸，警惕發(fā)展為重癥病例，對指導臨床診療、觀察病情和判斷預后具