Hemin誘導Ngb表達對實驗性大鼠腦缺血保護作用的研究.pdf

1、背景與目的： 腦血管病(CerebralVascularDisease，CVD)以其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率成為嚴重威脅人類健康的一大類重要疾病。在我國死于腦血管病者多于心臟病及癌癥，居三大死因首位。其中缺血性腦血管病(IschemicCerebralVascularDisease，ICVD)占60％～80％。隨著當今社會的老齡化，其發(fā)病率還在不斷增高，如何有效的降低死亡率和致殘率是治療缺血性卒中的核心問題。 ICV

2、D的主要病理生理變化是局部腦組織缺血缺氧，由此引發(fā)一系列病理性代謝或信號轉(zhuǎn)導過程，如自由基的過度形成及“瀑布式”自由基連鎖反應、神經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的細胞毒作用和酸中毒、細胞凋亡等，從而導致神經(jīng)細胞損傷。 ICVD治療的關鍵是及時恢復缺血部位供血，如何延長可進行有效干預的治療時間窗，從而為恢復組織供血供氧爭取寶貴時間是目前研究的熱點和難點之一。細胞對缺氧或缺血適應的一個明顯特征是缺氧誘導蛋白表達上調(diào)，例如具有保護大腦免

3、受缺血損害能力的蛋白，如缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducibletranscriptionfactor,HIF-1)、紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)，這些蛋白可能通過不同的機制發(fā)揮作用，但它們對缺氧的反應性最終取決于能夠感知缺氧并誘發(fā)適當?shù)募毎m應

4、的氧合血紅蛋白。腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是近來發(fā)現(xiàn)的在腦中特異表達的新型攜氧球蛋白。SunY等發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元被去除氧時，腦紅蛋白的表達上升，用反義寡核苷酸技術去除腦紅蛋白的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些細胞更容易受缺氧的影響。他們還以腺相關病毒(adeno-associatedvirus,AAV)為載體將NgbcDNA轉(zhuǎn)染入急性大腦中動脈閉塞大鼠腦神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)腦梗死面積較對照組減少了約50％，而利用反義寡核苷酸技術減少其

5、Ngb表達時，腦梗死面積較對照組增加60％，進一步證實Ngb對腦的保護作用。而離體實驗發(fā)現(xiàn)，氯化血紅素(Hemin)可以誘導神經(jīng)元Ngb表達，且呈時間和濃度依賴性。 為此，我們制作了SD(Sprague-Dawlay)大鼠大腦中動脈閉塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型，通過術后在體注射Hemin，觀察大鼠腦含水量、腦梗死體積及缺血組織Ngb表達情況，探討其對Ngb誘導表達的機制，同時也

6、為Hemin防治缺血缺氧性腦損傷提供可靠的實驗依據(jù)。 方法： 采用改良后的Zea-Longa法制作大鼠右側(cè)MCAO模型，100只大鼠隨機分為5組：假手術對照組(正常對照組)，手術組(MCAO組)，術后1hHemin干預組，術后2hHemin干預組，術后6hHemin干預組。各Hemin干預組大鼠均于術后相應時相點在體腹腔注射濃度為12.5g/L的Hemin(50mg/Kg)，各組大鼠于術后24小時斷頭處死，行腦組織TTC

7、染色用于檢測腦梗死體積、腦組織含水量測定、病理觀察、Ngb蛋白免疫組化分析和WesternBlot分析。采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行分析。 實驗結(jié)果： 1.大鼠局灶性腦缺血模型制備：按照Zea-Longa行為學評分法觀察，手術組、Hemin各干預組大鼠均于術后出現(xiàn)右側(cè)Homer's征，左前爪不能前伸，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或向左側(cè)傾倒，假手術對照組未出現(xiàn)上述神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀。術中有6只大鼠因麻醉過量死亡，3只術后24小時

8、內(nèi)死亡。模型制作成功率為91％。 2.腦組織含水量測定：手術組及術后各時相點Hemin干預組大鼠腦含水量較假手術對照組均有非常顯著升高(P＜0.01)。與手術組比較，術后各時相點Hemin干預組大鼠腦含水量下降非常顯著(P＜0.01)。各干預組間比較，術后1hHemin干預組腦含水量與術后2hHemin干預組無明顯差異(P＞O.05)，較術后6hHemin干預組下降顯著(P＜0.05)。 3.腦梗死體積測定：大鼠腦冠狀切

9、片經(jīng)2％TTC(2，3，5-Triphenyltetrazoliumchloride)染色后，梗死腦組織呈蒼白色。將切片掃描入掃描儀中，運行ImageProPlus4.5(IPP)圖像處理軟件，計算腦梗死面積及層面總面積，應用公式：V=(A1+…An)t(V：梗死體積或全腦體積，t：切片厚度，A：各切片梗死面積及總面積)計算腦梗死體積及全腦體積，對腦梗死體積比(腦梗死體積/全腦體積)進行統(tǒng)計學分析。手術組、術后各時相點Hemin干預組大

10、鼠腦梗死灶均位于右側(cè)額葉、頂葉、顳葉、部分枕區(qū)及基底節(jié)區(qū)。單因素方差分析提示術后1hHemin干預組腦梗死體積比較手術組縮小非常顯著(P＜0.01)，術后2h、術后6hHemin干預組腦梗死體積比較手術組均顯著縮小(P＜0.05)，各時相點Hemin干預組間比較，術后1hHemin干預組腦梗死體積比較術后2h、術后6hHemin干預組縮小顯著(P＜0.05)，術后2h與術后6hHemin干預組腦梗死體積比較無顯著差異(P＞0.05)。

11、 4.光鏡下病理觀察：假手術對照組未見腦組織缺血改變。其余各組均可見顳項葉程度不同組織水腫及神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為缺血區(qū)淡染，錐體細胞呈三角形，細胞周圍間隙增大，細胞核深染，胞體皺縮或溶解。比較各時相點Hemin干預組與手術組可見，術后1hHemin干預組上述神經(jīng)病理損害表現(xiàn)明顯減輕。 5.免疫組織化學染色：各組大鼠均行右側(cè)頂葉皮層下觀察，Ngb免疫陽性(Ngb-IR)細胞呈棕色，陽性物質(zhì)定位于神經(jīng)元胞質(zhì)中，陰性對照片未見

12、著色。其中，手術組、各時相點Hemin干預組缺血區(qū)Ngb陽性神經(jīng)元數(shù)量較假手術對照組對應區(qū)域明顯減少，各時相點Hemin干預組缺血區(qū)Ngb陽性神經(jīng)元數(shù)量較手術組增多，以術后1hHemin干預組最明顯。 6.WesternBlot分析：通過WesternBlot對Ngb進行半定量分析，可見相對分子量在17000處各樣品顯示出一條特異性蛋白質(zhì)條帶，將各樣品條帶行積分光密度掃描，對手術組及各時相點Hemin干預組與假手術對照組積分光密

13、度值比值進行統(tǒng)計學分析提示，與假手術對照組比較，手術組、術后各時相點Hemin干預組均有非常顯著增高(p＜0.01)。各組兩兩比較后，術后1hHemin干預組較手術組增高非常顯著(p＜0.01)，術后2hHemin干預組較手術組增高顯著(p＜0.05)，術后6hHemin組與手術組比較無明顯差異(p＞0.05)。 結(jié)論： 1.采用Zea-Longa法改良后制作大鼠MCAO模型，避免了開顱等外在因素的影響，對生理指標影響小

14、，具有成功率高、可重復性好、復制速度快等優(yōu)點。 2.急性局灶性腦缺血后在體注射Hemin可以減輕腦水腫，減少腦梗死體積，干預時機越早越好。腦缺血后1h干預效果優(yōu)于術后2h及術后6h干預，與人類臨床急性缺血性腦血管病治療時間窗概念相吻合。 3.急性局灶性腦缺血后Ngb表達可能上調(diào)。 4.急性局灶性腦缺血狀態(tài)下在體注射Hemin可以誘導Ngb升高，干預時機越早，Ngb誘導表達越多。 5.Hemin對缺血腦保護