Hemin誘導(dǎo)Ngb表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景與目的： 腦血管病(CerebralVascularDisease，CVD)以其高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率成為嚴(yán)重威脅人類健康的一大類重要疾病。在我國(guó)死于腦血管病者多于心臟病及癌癥，居三大死因首位。其中缺血性腦血管病(IschemicCerebralVascularDisease，ICVD)占60％～80％。隨著當(dāng)今社會(huì)的老齡化，其發(fā)病率還在不斷增高，如何有效的降低死亡率和致殘率是治療缺血性卒中的核心問(wèn)題。 ICV

2、D的主要病理生理變化是局部腦組織缺血缺氧，由此引發(fā)一系列病理性代謝或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，如自由基的過(guò)度形成及“瀑布式”自由基連鎖反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸的細(xì)胞毒作用和酸中毒、細(xì)胞凋亡等，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷。 ICVD治療的關(guān)鍵是及時(shí)恢復(fù)缺血部位供血，如何延長(zhǎng)可進(jìn)行有效干預(yù)的治療時(shí)間窗，從而為恢復(fù)組織供血供氧爭(zhēng)取寶貴時(shí)間是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。細(xì)胞對(duì)缺氧或缺血適應(yīng)的一個(gè)明顯特征是缺氧誘導(dǎo)蛋白表達(dá)上調(diào)，例如具有保護(hù)大腦免

3、受缺血損害能力的蛋白，如缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducibletranscriptionfactor,HIF-1)、紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)，這些蛋白可能通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮作用，但它們對(duì)缺氧的反應(yīng)性最終取決于能夠感知缺氧并誘發(fā)適當(dāng)?shù)募?xì)胞適應(yīng)

4、的氧合血紅蛋白。腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的在腦中特異表達(dá)的新型攜氧球蛋白。SunY等發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元被去除氧時(shí)，腦紅蛋白的表達(dá)上升，用反義寡核苷酸技術(shù)去除腦紅蛋白的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞更容易受缺氧的影響。他們還以腺相關(guān)病毒(adeno-associatedvirus,AAV)為載體將NgbcDNA轉(zhuǎn)染入急性大腦中動(dòng)脈閉塞大鼠腦神經(jīng)元中，發(fā)現(xiàn)腦梗死面積較對(duì)照組減少了約50％，而利用反義寡核苷酸技術(shù)減少其

5、Ngb表達(dá)時(shí)，腦梗死面積較對(duì)照組增加60％，進(jìn)一步證實(shí)Ngb對(duì)腦的保護(hù)作用。而離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氯化血紅素(Hemin)可以誘導(dǎo)神經(jīng)元Ngb表達(dá)，且呈時(shí)間和濃度依賴性。 為此，我們制作了SD(Sprague-Dawlay)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)模型，通過(guò)術(shù)后在體注射Hemin，觀察大鼠腦含水量、腦梗死體積及缺血組織Ngb表達(dá)情況，探討其對(duì)Ngb誘導(dǎo)表達(dá)的機(jī)制，同時(shí)也

6、為Hemin防治缺血缺氧性腦損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 采用改良后的Zea-Longa法制作大鼠右側(cè)MCAO模型，100只大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)對(duì)照組(正常對(duì)照組)，手術(shù)組(MCAO組)，術(shù)后1hHemin干預(yù)組，術(shù)后2hHemin干預(yù)組，術(shù)后6hHemin干預(yù)組。各Hemin干預(yù)組大鼠均于術(shù)后相應(yīng)時(shí)相點(diǎn)在體腹腔注射濃度為12.5g/L的Hemin(50mg/Kg)，各組大鼠于術(shù)后24小時(shí)斷頭處死，行腦組織TTC

7、染色用于檢測(cè)腦梗死體積、腦組織含水量測(cè)定、病理觀察、Ngb蛋白免疫組化分析和WesternBlot分析。采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.大鼠局灶性腦缺血模型制備：按照Z(yǔ)ea-Longa行為學(xué)評(píng)分法觀察，手術(shù)組、Hemin各干預(yù)組大鼠均于術(shù)后出現(xiàn)右側(cè)Homer's征，左前爪不能前伸，向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或向左側(cè)傾倒，假手術(shù)對(duì)照組未出現(xiàn)上述神經(jīng)系統(tǒng)缺損癥狀。術(shù)中有6只大鼠因麻醉過(guò)量死亡，3只術(shù)后24小時(shí)

8、內(nèi)死亡。模型制作成功率為91％。 2.腦組織含水量測(cè)定：手術(shù)組及術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組大鼠腦含水量較假手術(shù)對(duì)照組均有非常顯著升高(P＜0.01)。與手術(shù)組比較，術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組大鼠腦含水量下降非常顯著(P＜0.01)。各干預(yù)組間比較，術(shù)后1hHemin干預(yù)組腦含水量與術(shù)后2hHemin干預(yù)組無(wú)明顯差異(P＞O.05)，較術(shù)后6hHemin干預(yù)組下降顯著(P＜0.05)。 3.腦梗死體積測(cè)定：大鼠腦冠狀切

9、片經(jīng)2％TTC(2，3，5-Triphenyltetrazoliumchloride)染色后，梗死腦組織呈蒼白色。將切片掃描入掃描儀中，運(yùn)行ImageProPlus4.5(IPP)圖像處理軟件，計(jì)算腦梗死面積及層面總面積，應(yīng)用公式：V=(A1+…An)t(V：梗死體積或全腦體積，t：切片厚度，A：各切片梗死面積及總面積)計(jì)算腦梗死體積及全腦體積，對(duì)腦梗死體積比(腦梗死體積/全腦體積)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。手術(shù)組、術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組大

10、鼠腦梗死灶均位于右側(cè)額葉、頂葉、顳葉、部分枕區(qū)及基底節(jié)區(qū)。單因素方差分析提示術(shù)后1hHemin干預(yù)組腦梗死體積比較手術(shù)組縮小非常顯著(P＜0.01)，術(shù)后2h、術(shù)后6hHemin干預(yù)組腦梗死體積比較手術(shù)組均顯著縮小(P＜0.05)，各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組間比較，術(shù)后1hHemin干預(yù)組腦梗死體積比較術(shù)后2h、術(shù)后6hHemin干預(yù)組縮小顯著(P＜0.05)，術(shù)后2h與術(shù)后6hHemin干預(yù)組腦梗死體積比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

11、 4.光鏡下病理觀察：假手術(shù)對(duì)照組未見(jiàn)腦組織缺血改變。其余各組均可見(jiàn)顳項(xiàng)葉程度不同組織水腫及神經(jīng)元變性壞死，表現(xiàn)為缺血區(qū)淡染，錐體細(xì)胞呈三角形，細(xì)胞周圍間隙增大，細(xì)胞核深染，胞體皺縮或溶解。比較各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組與手術(shù)組可見(jiàn)，術(shù)后1hHemin干預(yù)組上述神經(jīng)病理?yè)p害表現(xiàn)明顯減輕。 5.免疫組織化學(xué)染色：各組大鼠均行右側(cè)頂葉皮層下觀察，Ngb免疫陽(yáng)性(Ngb-IR)細(xì)胞呈棕色，陽(yáng)性物質(zhì)定位于神經(jīng)元胞質(zhì)中，陰性對(duì)照片未見(jiàn)

12、著色。其中，手術(shù)組、各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組缺血區(qū)Ngb陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較假手術(shù)對(duì)照組對(duì)應(yīng)區(qū)域明顯減少，各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組缺血區(qū)Ngb陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較手術(shù)組增多，以術(shù)后1hHemin干預(yù)組最明顯。 6.WesternBlot分析：通過(guò)WesternBlot對(duì)Ngb進(jìn)行半定量分析，可見(jiàn)相對(duì)分子量在17000處各樣品顯示出一條特異性蛋白質(zhì)條帶，將各樣品條帶行積分光密度掃描，對(duì)手術(shù)組及各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組與假手術(shù)對(duì)照組積分光密

13、度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示，與假手術(shù)對(duì)照組比較，手術(shù)組、術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)Hemin干預(yù)組均有非常顯著增高(p＜0.01)。各組兩兩比較后，術(shù)后1hHemin干預(yù)組較手術(shù)組增高非常顯著(p＜0.01)，術(shù)后2hHemin干預(yù)組較手術(shù)組增高顯著(p＜0.05)，術(shù)后6hHemin組與手術(shù)組比較無(wú)明顯差異(p＞0.05)。 結(jié)論： 1.采用Zea-Longa法改良后制作大鼠MCAO模型，避免了開(kāi)顱等外在因素的影響，對(duì)生理指標(biāo)影響小

14、，具有成功率高、可重復(fù)性好、復(fù)制速度快等優(yōu)點(diǎn)。 2.急性局灶性腦缺血后在體注射Hemin可以減輕腦水腫，減少腦梗死體積，干預(yù)時(shí)機(jī)越早越好。腦缺血后1h干預(yù)效果優(yōu)于術(shù)后2h及術(shù)后6h干預(yù)，與人類臨床急性缺血性腦血管病治療時(shí)間窗概念相吻合。 3.急性局灶性腦缺血后Ngb表達(dá)可能上調(diào)。 4.急性局灶性腦缺血狀態(tài)下在體注射Hemin可以誘導(dǎo)Ngb升高，干預(yù)時(shí)機(jī)越早，Ngb誘導(dǎo)表達(dá)越多。 5.Hemin對(duì)缺血腦保護(hù)