內(nèi)支架法自體組織修補(bǔ)膽管缺損的體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分模擬內(nèi)支架環(huán)境下成纖維細(xì)胞增殖的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究目的：在體外模擬內(nèi)支架自體材料膽道吻合的膽道環(huán)境,觀察作為膽道瘢痕修復(fù)重要元素的成纖維細(xì)胞的增殖情況。
　　 研究方法：利用體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞,模擬體內(nèi)的膽汁環(huán)境,利用顯微鏡觀察、MTT法測(cè)量不同環(huán)境下成纖維細(xì)胞的增殖和雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)分析其成纖維細(xì)胞凋亡率來(lái)研究膽管瘢痕愈合過(guò)程中膽汁的作用。實(shí)驗(yàn)組膽汁環(huán)境用加入1％的膽汁建立,對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液。

2、>　　 結(jié)果：顯微鏡觀察膽汁環(huán)境培養(yǎng)48小時(shí)后實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞的增殖多于對(duì)照組；膽汁培養(yǎng)48小時(shí)及72小時(shí)后不同濃度的成纖維細(xì)胞的OD570值較對(duì)照組升高均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)在膽汁環(huán)境中培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組低,比較可見(jiàn)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論：膽汁環(huán)境中可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖并向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,膽汁抑制了成纖維細(xì)胞的凋亡。
　　 可以認(rèn)為內(nèi)支架膽道對(duì)端吻

3、合的術(shù)式隔絕了膽汁環(huán)境對(duì)吻合口的刺激和影響,在一定程度上降低了因膽汁刺激引起的成纖維細(xì)胞增殖和向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化導(dǎo)致的膽道瘢痕過(guò)度愈合,為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù)。
　　 第二部分內(nèi)支架法自體組織修補(bǔ)膽管缺損的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究
　　 研究目的：通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證內(nèi)支架法自體組織修補(bǔ)膽管缺損的可行性和安全性。
　　 研究方法：利用已有的可降解膽道支架,選取巴馬小型豬為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,隨機(jī)分為兩組,每組15頭。動(dòng)物手術(shù)構(gòu)建

4、膽總管缺損的模型,實(shí)驗(yàn)組采用內(nèi)支架法自體組織修補(bǔ)膽管缺損:將設(shè)計(jì)的可降解支架與膽管兩端捆綁連接,支架中部保留1.0cm的膽管缺損并用自體大網(wǎng)膜修補(bǔ)；對(duì)照組采用膽管對(duì)端吻合術(shù)。術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物黃疸和膽漏情況；術(shù)后2周,1月,3月每個(gè)實(shí)驗(yàn)組各處死5頭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,分別比較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身術(shù)前和術(shù)后2周,1月,3月炎癥指標(biāo)(CBC,CRP)、肝酶(ALT、AST、ALP)和血總膽紅素的變化；觀察兩實(shí)驗(yàn)組大體標(biāo)本、肝臟組織病理切片HE染色、吻合口病理形

5、態(tài)學(xué)改變:包括HE染色、Masson染色和α-SMA、TGF-β1、b-FGF免疫組化染色；術(shù)后1月及3月兩實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行膽道造影；測(cè)定術(shù)后2周,1月,3月時(shí)吻合口的羥脯氨酸含量；利用相對(duì)定量RT-PCR檢測(cè)術(shù)后2周,1月,3月時(shí)吻合口α-SMA、TGF-β1.b-FGF mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：兩實(shí)驗(yàn)組均順利完成手術(shù),術(shù)后無(wú)黃疸及膽漏發(fā)生。兩實(shí)驗(yàn)組炎癥指標(biāo)(CBC、CRP)的檢測(cè)中,除對(duì)照組術(shù)后2周及3月白

6、細(xì)胞計(jì)數(shù)升高具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)外,其余結(jié)果無(wú)顯著差異；肝功能及總膽紅素檢測(cè)提示除對(duì)照組術(shù)后3月ALT、AST、ALP升高較術(shù)前具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3月、對(duì)照組術(shù)后1月、3月總膽紅素升高較術(shù)前具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其余結(jié)果無(wú)顯著差異(P>0.05)。
　　 實(shí)驗(yàn)組術(shù)后2周及1月可及手術(shù)用可降解支架在位,吻合口局部輕度水腫充血,術(shù)后3月支架已降解消失,吻合口充血水腫已基本消退。對(duì)照組術(shù)后2周及1

7、月吻合口局部輕度水腫充血,術(shù)后3月可見(jiàn)近端膽管輕度擴(kuò)張,吻合口略狹窄。
　　 實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物術(shù)后1月及3月膽道造影提示:吻合處無(wú)造影劑滲漏,肝內(nèi)膽管顯影未見(jiàn)擴(kuò)張,膽總管引流通暢,十二指腸顯影佳。對(duì)照組可見(jiàn)膽管下段通暢,十二指腸顯影良好,但部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(術(shù)后1月組:1頭／5頭,術(shù)后3月組:1頭／5頭)肝內(nèi)外膽管有不同程度的擴(kuò)張。
　　 HE染色結(jié)果見(jiàn)術(shù)后2周可見(jiàn)吻合口水腫伴較多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞為主,粘膜下固有

8、層膠原纖維增生,可見(jiàn)小血管增生,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組增生的膠原較少；術(shù)后1月可見(jiàn)吻合口水腫已消退,炎性浸潤(rùn)較前有減輕,粘膜下膠原增生明顯伴有纖維化,纖維結(jié)構(gòu)紊亂,新生膽管上皮生長(zhǎng)伴有腺體增生,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組粘膜下纖維化和血管增生情況輕；術(shù)后3月可見(jiàn)吻合口新生膽管上皮生長(zhǎng),粘膜下膠原增厚明顯伴有纖維化,但纖維結(jié)構(gòu)紊亂情況較1月時(shí)好轉(zhuǎn),腺體增生減少,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組膠原增生情況輕。術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)肝臟HE染色均未見(jiàn)明顯淤膽情況發(fā)現(xiàn)。Masson染色見(jiàn)術(shù)

9、后1月膠原纖維增生伴有纖維化,排列較為紊亂,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組膠原增生程度輕,排列相對(duì)有序；術(shù)后3月膠原纖維增生伴有纖維化明顯,排列紊亂情況較前好轉(zhuǎn),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組膠原增生程度輕,排列相對(duì)有序。
　　 α-SMA免疫組化陽(yáng)性評(píng)分術(shù)后1月及3月兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),評(píng)分隨時(shí)間推移有增高趨勢(shì),TGF-β1免疫組化陽(yáng)性評(píng)分術(shù)后2周時(shí)兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),評(píng)分隨時(shí)間推移有下降趨勢(shì),b-FGF免疫組化陽(yáng)性評(píng)分術(shù)后1

10、月時(shí)兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),評(píng)分隨時(shí)間推移先上升后有下降趨勢(shì),術(shù)后1月時(shí)評(píng)分最高。
　　 術(shù)后2周時(shí)測(cè)定羥脯氨酸的含量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),術(shù)后1月和3月時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間比較具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 RT-PCR結(jié)果顯示術(shù)后2周時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF、TGF-β1 mRNA表達(dá)增加,α-SMA mRNA表達(dá)減少；術(shù)后1月時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF mRNA表達(dá)

11、增加,TGF-β1、α-SMA mRNA表達(dá)減少；術(shù)后3月時(shí)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組b-FGF、TGF-β1mRNA表達(dá)相似,α-SMA mRNA表達(dá)減少。
　　 結(jié)論：利用大網(wǎng)膜作自體材料的內(nèi)支架法膽道對(duì)端吻合術(shù)是一種操作簡(jiǎn)單,安全可行的膽道重建方式。
　　 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示利用大網(wǎng)膜作自體材料的內(nèi)支架法膽道對(duì)端吻合術(shù)較直接的膽道對(duì)端吻合術(shù)在近期預(yù)防膽道瘢痕過(guò)度愈合上具有優(yōu)勢(shì),操作簡(jiǎn)單可行,但支架的降解周期可能需適當(dāng)延長(zhǎng),仍需大