Spt4-Spt5結(jié)合DNA以及抗體E9結(jié)合ErbB2的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、基因表達(dá)是一個(gè)復(fù)雜并且受到多重調(diào)控的精細(xì)過程，包括了轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾三個(gè)過程，并受到多種蛋白質(zhì)復(fù)合物的調(diào)控?；虮磉_(dá)的第一步是轉(zhuǎn)錄，由RNA聚合酶催化，將遺傳信息從DNA傳遞到RNA。調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)被稱作轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子在原核、古核、真核三界中的保守程度并不高，但唯一例外的是Spt5/NusG家族。Spt5（原核中被稱作NusG）是唯一在三界中都存在的轉(zhuǎn)錄因子。在古核和真核生物中，Spt5可以和Spt4形成穩(wěn)定的異二聚體發(fā)

2、揮功能;但在原核生物中并不存在Spt4的同源蛋白，因而NusG獨(dú)自發(fā)揮功能。前人的工作已經(jīng)證明，Spt4∶Spt5復(fù)合物與RNA聚合酶直接相互作用，并結(jié)合在RNA聚合酶clamp結(jié)構(gòu)域的coiled-coil模體上。Spt4∶Spt5所處的這一位置位于DNA出口處，在這里，完成了轉(zhuǎn)錄的DNA重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，并通過DNA出口排出。
　　在本次工作中，我們通過核磁共振化學(xué)位移擾動(dòng)和熒光偏振實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)了Spt4∶Spt5結(jié)合DNA

3、的能力;并通過解析和分析MjSpt4∶Spt5的晶體結(jié)構(gòu)，猜測(cè)了一個(gè)位于Spt4∶Spt5上可能的DNA結(jié)合區(qū)域;并從兩套衍射數(shù)據(jù)解析的模型中捕捉到了Spt4∶Spt5兩種不同的構(gòu)象，進(jìn)而分析了兩種構(gòu)象對(duì)Spt4∶Spt5結(jié)合DNA能力的影響;通過結(jié)合定點(diǎn)突變和熒光偏振實(shí)驗(yàn)，我們最終構(gòu)建了一個(gè)Spt4∶Spt5結(jié)合DNA的模型，進(jìn)而構(gòu)建了一個(gè)包含了RNA聚合酶、Spt4∶Spt5復(fù)合物和DNA三個(gè)元素的RNA聚合酶DNA出口模型，并通過

4、生化實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬驗(yàn)證了此模型的正確性。
　　ErbB2隸屬于酪氨酸蛋白激酶家族中的表皮生長(zhǎng)因子受體亞家族，這類跨膜蛋白通過胞外結(jié)構(gòu)域的二聚化激活其胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而互相催化對(duì)方的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域C末端尾巴并進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路。ErbB2負(fù)責(zé)調(diào)控包括細(xì)胞復(fù)制和凋亡的多條重要信號(hào)通路，其活性異常會(huì)導(dǎo)致乳腺癌等近十種癌癥，并有著更高轉(zhuǎn)移性。因而，近年來ErbB2成為了抗腫瘤治療的重要靶標(biāo)分子。
　　中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)的細(xì)

5、胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室近年來一直致力于抗ErbB2抗體的研發(fā)，并開發(fā)了一株具有抗腫瘤活性的人鼠嵌合抗體chA21。近期，該實(shí)驗(yàn)室完成了對(duì)chA21的人源化，并通過親和力成熟技術(shù)制備了具有高親和力的人源化抗ErbB2抗體E9。我們與細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室合作，通過X射線衍射方法解析了E9 scFv片段與ErbB2完整胞外結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，確認(rèn)了E9在ErbB2上的結(jié)合位置;并發(fā)現(xiàn)在抗原—抗體結(jié)合界面上，原先chA21所結(jié)合的抗原表面三條lo