AML骨髓微環(huán)境中TPO-c-MPL的表達及功能研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　 骨髓微環(huán)境是以基質(zhì)細胞為主體，多種粘附分子和生長、趨化因子共同參與的三維結(jié)構(gòu)體，其功能發(fā)揮需要多細胞、多因子的復雜網(wǎng)絡(luò)體系的共同作用。其中基質(zhì)細胞本身即是一個包含了成骨細胞、成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、組織細胞等的細胞復合體。在相當長的時間內(nèi)，骨髓微環(huán)境的研究只是籠統(tǒng)的以體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)細胞為對象，觀察其粘附及分泌功能的變化是否對共培養(yǎng)的白血病細胞產(chǎn)生影響。自從1978年Schofield首先將“龕”的定義引入

2、骨髓用來描述造血干細胞的微環(huán)境后，近年來學者采用不同的技術(shù)方法在動物體內(nèi)研究了造血細胞龕在對造血干細胞生理功能維持中的作用。Purton等研究發(fā)現(xiàn)造血干細胞主要依靠成骨細胞和血管內(nèi)皮細胞兩種成分實現(xiàn)自我更新和多向分化，其中成骨細胞是成骨細胞龕的主要組成部分，它局限于骨髓腔內(nèi)表面，起到儲存長期培養(yǎng)造血干細胞并維持其生理功能的作用。在造血損傷恢復和骨髓移植模型中骨內(nèi)膜的成骨細胞周圍通常聚集著數(shù)量豐富的造血前體細胞。正常造血情況下，成骨細胞龕

3、可以支持造血干/祖細胞及長期培養(yǎng)啟動細胞的長期存活。
　　 急性髓系白血病的形成和發(fā)展與白血病異常的骨髓造血微環(huán)境密切相關(guān)，但白血病骨髓異常造血微環(huán)境的形成及在白血病細胞惡性造血中的作用機制尚不完全清楚。在白血病異常造血微環(huán)境中成骨細胞龕成為部分白血病細胞特別是白血病干/祖細胞定植、增殖的場所。靜止期白血病細胞休眠于成骨細胞龕內(nèi)以躲避理化因素的殺傷，并最終成為白血病化療后耐藥和復發(fā)的發(fā)源地。Hiroki等研究發(fā)現(xiàn)具有c-MPL高

4、表達的G0期造血干細胞均與成骨細胞緊密相連，造血干細胞靜止于這些龕位中免受理化因素的影響，在應激情況下能夠進入細胞周期，維持造血系統(tǒng)的正常運行。Yamazaki等通過阻斷TPO/c-MPL通路發(fā)現(xiàn)G0期長期培養(yǎng)造血干細胞數(shù)量明顯減少，認為TPO/c-MPL信號通路對于造血干細胞龕中的造血干細胞的自我更新及Go期的維持起到了重要作用。
　　 血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)與其受體c-MPL相互作用是促進巨核細

5、胞增殖、增加外周血血小板的數(shù)量的主要調(diào)節(jié)途徑，近年來的研究發(fā)現(xiàn)骨髓基質(zhì)細胞中成骨細胞具有分泌TPO的功能，而c-MPL不僅表達于不同成熟階段巨核細胞、早期造血干、祖細胞，在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性粒細胞白血病(chronic myelocytic leukemia，CML)及骨髓增生異常綜合癥(chronic myelocyticleukemia，MDS)患者的原始細胞中也均有較高表達

6、。鑒于成骨細胞分泌TPO的功能以及AML細胞c-MPL的高表達，本實驗在國家自然基金的支持下，首先檢測了初發(fā)及復發(fā)AML患者骨髓TPO及其受體c-MPL的表達，探討白血病難治復發(fā)與TPO/c-MPL表達水平之間的關(guān)系；然后在成功誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，并分別檢測成骨細胞TPO分泌和AML細胞株HEL細胞c-MPL表達的基礎(chǔ)上，通過體外構(gòu)建成骨細胞與AML細胞株二維共培養(yǎng)體系，探討TPO/c-MPL信號通路在成骨細胞龕庇護白血病細胞

7、免受化學藥物殺傷中的作用，并觀察共培養(yǎng)條件下白血病細胞株對化療藥物敏感性的變化，為后續(xù)在三維成骨細胞龕內(nèi)檢測阻斷TPO/c-MPL信號通路后對AML影響的深入研究奠定實驗基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 第一部分：AML患者骨髓TPO及受體c-MPL的表達及其意義
　　 1.AML患者及對照組骨髓單個核細胞樣本的制備
　　 2.流式細胞儀檢測AML患者白血病細胞及對照組骨髓單個核細胞c-MPL的表達

8、　　 3.ELISA法檢測AML患者及對照組骨髓上清TPO水平
　　 第二部分：不同來源成骨細胞TPO分泌及AML細胞株c-MPL表達的研究
　　 1.AML患者及對照組骨髓間充質(zhì)干細胞誘導向成骨細胞分化及其鑒定
　　 2.成骨細胞株hFOB1.19及白血病細胞株HEL及DAMI細胞的體外培養(yǎng)
　　 3.流式細胞儀檢測白血病細胞株HEL和DAMI c-MPL的表達分析
　　 4.ELISA法檢測

9、分離的骨髓單個核細胞、不同來源骨髓間充質(zhì)干細胞及其誘導分化的成骨細胞、hFOB1.19細胞TPO分泌水平
　　 第三部分 TPO/c-MPL通路對骨髓微環(huán)境庇護AML細胞作用的探討
　　 1.AML細胞株HEL與不同來源成骨細胞二維共培養(yǎng)體系的建立
　　 2.不同濃度柔紅霉素在體外共培養(yǎng)24H時各培養(yǎng)組HEL細胞株存活率的檢測
　　 結(jié)果：
　　 1.AML復發(fā)及初發(fā)患者骨髓單個核細胞c-MPL均

10、有較高表達，明顯高于對照組(P<0.05)，復發(fā)患者c-MPL表達明顯高于AML初發(fā)患者水平(P<0.05)；初發(fā)患者化療緩解后可降至正常水平(P>0.05)。
　　 2.ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)AML初發(fā)患者骨髓上清TPO表達水平高于對照組(P<0.05)，AML復發(fā)患者明顯高于初發(fā)患者(P<0.05)，初發(fā)患者化療緩解后與正常骨髓TPO表達無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.成功進行了AML患者骨髓間充質(zhì)干細胞體外培

11、養(yǎng)鑒定、向成骨細胞誘導分化以及成骨細胞株hFOB1.19、急性髓系白血病細胞株HEL體外培養(yǎng)。
　　 4.骨髓間充質(zhì)干細胞成骨誘導過程中TPO表達逐漸增多，同一誘導時相點AML骨髓誘導的成骨細胞表達水平高于正常骨髓誘導的成骨細胞(P<0.05)，成骨細胞株hFOB1.19細胞體外培養(yǎng)能夠分泌TPO。
　　 5.HEL細胞株c-MPL表達率為8.32%，DAMI細胞株c-MPL表達率為6.10%。
　　 6.共培養(yǎng)

12、24h時各組中HEL不同柔紅霉素濃度作用下存活呈橫S狀，符合藥物作用一般規(guī)律，其中HEL+AML來源成骨細胞各濃度下細胞存活率最大，HEL單獨培養(yǎng)組細胞存活率最低，HEL+hFOB1.19組與HEL+正常來源成骨細胞存活率無明顯差異。
　　 7.采用spss13.0軟件計算各培養(yǎng)組中柔紅霉素IC50值，A組HEL單獨培養(yǎng)組IC50為(1.643±0.108)ug/ml，D組HEL+AML來源成骨細胞為(3.320±0.218)u

13、g/ml，C組HEL+正常來源成骨細胞為(2.236±0.167)ug/ml，B組HEL+hFOB1.19組IC50為(2.254±0.111)ug/ml，A組中DNR明顯低于其他共培養(yǎng)組(P<0.05)，D組明顯高于其他組(P<0.05)，B組和C組無差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.TPO及c-MPL的高表達對AML的診斷具有提示意義。TPO及c-MPL在復發(fā)患者骨髓細胞的表達較AML初發(fā)患者明顯增高，

14、提示TPO/c-MPL信號通路的高表達可能與急性髓系白血病治療后復發(fā)及難治相關(guān)。
　　 2.AML骨髓間充質(zhì)干細胞誘導的成骨細胞TPO表達水平明顯高于對照組骨髓所誘導的成骨細胞及hFOB1.19成骨細胞株；AML細胞株c-MPL表達較高，尤以HEL細胞增高明顯。
　　 3.成骨細胞與AML白血病細胞體外共培養(yǎng)對白血病細胞株免受化療藥物的殺傷具有保護作用，高表達c-MPL的AML骨髓誘導的成骨細胞對白血病細胞的庇護作用更強