氧化型低密度脂蛋白活化血小板機(jī)理的初步探討.pdf

1、背景：
　　 隨著社會的發(fā)展和人們生活水平的提高、膽固醇攝入的增加，高脂血癥及動脈粥樣硬化疾病的發(fā)病率逐年上升。作為動脈粥樣硬化的主要疾病、目前冠心病已成為我國人群死亡的主要病因。已明確動脈粥樣硬化斑塊的形成及斑塊不穩(wěn)定導(dǎo)致的局部血栓是冠心病、急性冠脈綜合征(ACS)發(fā)生的重要病理環(huán)節(jié)，研究已經(jīng)肯定低密度脂蛋白及血小板在其中扮演主要角色，兩者是冠心病研究的重要課題。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density l

2、ipoprotein，ox-LDL)是低密度脂蛋白致動脈粥樣硬化的主要活性成份，近期文獻(xiàn)報道ox-LDL除致斑塊形成外、對血小板活化也有直接的促進(jìn)作用，在動脈血栓的形成過程中可能發(fā)揮重要作用，但具體機(jī)制尚缺乏深入研究。因此，研究ox-IDL對血小板活化的影響對闡明冠心病的發(fā)病機(jī)理、防治ACS臨床事件的發(fā)生意義重大。
　　 作為動脈血栓形成的核心環(huán)節(jié)，盡管還有許多有待闡明的具體環(huán)節(jié)，血小板活化的主要步驟已得到充分的研究。研究顯示：

3、血小板活化時，其胞膜上的花生四烯酸(AA)在環(huán)氧化酶1(COX-1)的催化下合成血栓烷A2(TXA2)，后者可擴(kuò)散到胞膜外進(jìn)而活化其他血小板。血小板上有兩種TXA2受體：TPα和TPβ，兩者均可與蛋白Gq、G12/13偶聯(lián)。在血管損傷部位，循環(huán)中的凝血酶原迅速生成凝血酶，后者可與血小板表面的蛋白酶激活受體(PAR1和PAR4)反應(yīng)，激活與之偶聯(lián)的Gq、G12/13和Gi蛋白，啟動活化過程，并促進(jìn)血小板胞漿顆粒內(nèi)容物的釋放。其中血小板致密

4、顆粒內(nèi)的ADP，可擴(kuò)散到胞膜外激活血小板表面的P2Y1和P2Y12受體，并使偶聯(lián)的Gq和Gi蛋白發(fā)生構(gòu)型改變。構(gòu)型改變了的Gq蛋白可激活磷脂酶C(PLC)，后者可催化降解磷酸肌醇生成三磷酸肌醇(IP3)和二?；视?DAG)。DAG能夠激活血小板內(nèi)蛋白激酶C(PKC)進(jìn)而引起蛋白磷酸化，IP3則促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放，使胞漿中Ca2+的水平升高。Gi蛋白可抑制腺苷酸環(huán)化酶(AC)的活性并促進(jìn)PI3K的活性。AC活性的下降可降低胞漿環(huán)

5、一磷酸腺苷(cAMP)的水平，使磷酸化的血管舒張劑刺激磷蛋白(VASP)去磷酸化。PI3K活性升高可使Akt磷酸化增強(qiáng)，進(jìn)而通過mTORs并與VASP一起活化GpⅡb/Ⅲa受體。G12/13蛋白可與Rho鳥苷酸交換因子(RhoGEFs)結(jié)合，誘發(fā)Rho因子介導(dǎo)的細(xì)胞骨架反應(yīng)，從而導(dǎo)致血小板形狀改變。最后促進(jìn)血小板的粘附、聚集，導(dǎo)致血小板血栓形成。
　　 在上述血小板活化過程中，P2Y12受體占據(jù)中心地位，因為其活化不但可以激活血

6、小板，還可以放大和維持TXA2和凝血酶引起的血小板的活化，穩(wěn)定形成的血栓。在研究高脂血癥對血小板功能影響的過程中，考慮到高脂血癥中最重要的致病因素是ox-LDL，而P2Y12受體在血小板活化中又占有中心地位，因而選擇ox-LDL對血小板活性的影響以及ox-LDL是否可通過P2Y12受體促進(jìn)血小板活化是關(guān)鍵的切入點，對闡明動脈血栓機(jī)制具有重要的意義。
　　 目的：
　　 1進(jìn)一步明確ox-LDL對不同血小板活化指標(biāo)的影響；

7、
　　 2.初步探討ox-LDL活化血小板的具體機(jī)制，重點明確ox-LDL是否可通過P2Y12受體活化血小板。
　　 方法：
　　 通過改良沉淀和硫酸銅氧化法制備ox-LDL。按文獻(xiàn)報道，將不同濃度的ox-LDL分別與成年健康者的血小板孵育5分鐘后，分別檢測ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率、纖維蛋白原誘導(dǎo)的鋪展面積和血小板表面活化的GpⅡb/Ⅲa受體數(shù)目，從而觀察ox-LDL對上述血小板活化指標(biāo)的影響。然后通過檢測致

8、密顆粒內(nèi)ADP的釋放、P2Y12受體下游信號cAMP、VASP和Akt的水平來初步探討ox-LDL活化血小板的機(jī)制。
　　 1.ox-LDL制備和鑒定及血小板的準(zhǔn)備；
　　 1.1 ox-LDL的制備和鑒定：采用改良沉淀法提取人血漿低密度脂蛋白(low densitylipoprotein，LDL)，然后以0.01mmol/L的硫酸銅氧化24-48小時制備ox-LDL，以硫代巴比妥酸(thiobarbituric aci

9、d，TBA)檢測ox-LDL的氧化修飾程度，并以BCA法測定蛋白濃度；
　　 1.2血小板的制備：自志愿者肘部靜脈取血36ml，以1:6的右旋枸櫞酸ACD抗凝，常溫300g離心10分鐘，分離富血小板血漿，然后900g離心10分鐘，分離血小板，重懸在含0.02U/mL apyrase的苔氏液(Tyrode buffer)中，并將血小板終濃度調(diào)整至2.5×108個/毫升。
　　 2.ox-LDL對血小板活化指標(biāo)的影響

10、　　 2.1以10uM的ADP刺激不同濃度ox-LDL孵育后的血小板，使用雙通道血小板聚集儀以1cm/min的走紙速度、測定苔氏液參比下的最大聚集率，觀察ox-LDL對血小板聚集率的影響；
　　 2.2血小板鋪展及面積測量。實驗組血小板預(yù)先與ox-LDL共孵育5min，對照組未做處理。用20μg/mL的纖維蛋白原包被chamber后，將標(biāo)本接種于chamber內(nèi)，以玫瑰紅-鬼筆環(huán)肽熒光染料染色，37℃孵育45分鐘，4％多聚甲醛

11、固定，染色，熒光顯微鏡下觀察。在低倍視野下比較未鋪展血小板數(shù)目，在高倍視野下觀察血小板鋪展面積；
　　 2.3全血法流式細(xì)胞術(shù)檢測干預(yù)前后血小板膜表面纖維蛋白原受體(PAC-1)GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物的表達(dá)。取出30μl全血，加入緩沖液稀釋至300μl；每一標(biāo)本取流式管A、B，均加入上述液體30μl；加入60μg/ml的ox-LDL共孵育，在30分鐘、60分鐘、120分鐘分別取出10μl1。A管：PAC-1(FITC標(biāo)記)、CD4

12、2b(APC標(biāo)記)，B管：PAC-1同型、CD42b(APC標(biāo)記)；室溫避光孵育15min；最后加入1％多聚甲醛，置于4℃避光保存，1小時內(nèi)流式細(xì)胞儀上檢測。血小板PAC-1及CD62p含量以其陽性血小板百分率表示。使用SystemⅡ軟件采集樣本，參照陰性空白對照，用EXPO TM32 Multicomp軟件分析數(shù)據(jù)，得出PAC-1-FITC抗體熒光的百分率；
　　 3.ox-LDL活化血小板的具體機(jī)制探討
　　 3.1

13、蟲熒光素-熒光素酶標(biāo)記的ATP曲線測定。血小板活化時，其致密顆粒內(nèi)容物(如ADP和ATP)釋放，可以通過血小板聚集儀和蟲熒光素-熒光素酶觀察血小板胞漿內(nèi)內(nèi)ATP含量的變化來間接反映ADP的釋放。加用ox-LDL預(yù)先孵育血小板5min，再用ADP刺激血小板時，測量蟲熒光素-熒光素酶標(biāo)記的ATP曲線，并與不加ox-LDL的標(biāo)本對照，觀察ox-LDL對血小板致密顆粒內(nèi)ADP釋放的影響；
　　 3.2血小板P2Y12受體下游cAMP的測

14、定：
　　 獲得富血小板血漿，加入2μCi/mL[74 kBq/mL][3H]腺嘌呤和1mM的阿司匹林，37℃孵育1小時，通過[3H]腺嘌呤標(biāo)記血小板內(nèi)的ATP，離心分離血小板，重懸在含apyrase0.02 U/mL的苔氏液中。加入ox-LDL預(yù)先孵育5分鐘，恒定攪拌速度900 rpm，將血小板與ox-LDL共孵育后，加入ADP刺激，然后利用柱層析法分離ATP和cAMP，并使用液閃儀測定含[3H]標(biāo)記的cAMP和ATP，最后通

15、過公式：{[3H]cAMP/([3H]ATP+[3H]cAMP)x103}，計算血小板內(nèi)自ATP轉(zhuǎn)化生成的cAMP濃度；
　　 3.3血小板P2Y12受體下游磷酸化VASP的測量
　　 采用ox-LDL處理血小板，加入SDS細(xì)胞裂解液和SDS蛋白上樣緩沖液液制備樣品，以10％的分離膠和5％的濃縮膠分別加入80μl預(yù)染蛋白和10μl的血小板樣品，60V-110V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳1小時分離VASP；結(jié)束后進(jìn)行蛋白質(zhì)全濕

16、法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上1.5小時，加入終止液1.5小時；然后加入1:1000的p-VASP兔抗人單克隆抗體，4℃過夜孵育；以洗滌液洗滌3次(搖床上連續(xù)搖動)，再加入1:2000標(biāo)有辣根過氧化物酶的山羊抗兔二抗，常溫孵育2小時；洗滌3次后加1:1的發(fā)光試劑發(fā)光約5分鐘；暗室曝光30秒，顯像，定影。通過、western-blot檢測分析磷酸化的VASP水平。
　　 3.4 ox-LDL影響血小板內(nèi)Akt濃度的測量：采用上述方法用o

17、x-LDL處理血小板，血小板裂解后液制備樣品，以10％的分離膠和5％的濃縮膠分別加入80μl預(yù)染蛋白和10μl的血小板樣品，60-110V電壓聚丙烯酰胺凝膠電泳1小時分離Akt；結(jié)束后進(jìn)行蛋白質(zhì)全濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上1.5小時，加入終止液1.5小時；然后加入1:1000加入p-Akt兔抗人單克隆抗體，4℃過夜孵育；洗滌液洗滌3次，再加入1:2000標(biāo)有辣根過氧化物酶的山羊抗兔二抗，常溫孵育2小時；洗滌3次后加1:1的發(fā)光試劑發(fā)光約

18、5分鐘；暗室曝光30秒，顯像，定影。通過western-blot檢測分析AM的水平；
　　 4.統(tǒng)計分析。每個實驗重復(fù)3～6次，文中采用的圖片均為有代表性的圖片。實驗數(shù)據(jù)中，正態(tài)分布的計量資料錄入Microsoft excel工作表，計算組內(nèi)均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SE)表示，組間比較采用t檢驗，以p＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.ox-LDL制備和鑒定：
　　 人血漿分離

19、LDL，經(jīng)5％瓊脂糖電泳證實為單一條帶。LDL氧化程度由TBARS值(單位：nM MDA/ml)反映。實驗結(jié)果顯示：新鮮LDL的值為3.69±0.47，而ox-LDL的值為30.72±2.24，ox-LDL的MDA含量明顯增高，且ox-LDL的TBARS值大于LDL的TBARS值5倍以上，兩者相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(p＜0.05)，提示ox-LDL的脂質(zhì)被有效氧化。脂蛋白電泳也證實，ox-LDL瓊脂糖電泳相對遷移率升高，提示LDL已被有效

20、氧化，可用于后續(xù)實驗。經(jīng)BCA法測定蛋白濃度為2.56g/L。
　　 2.ox-LDL對血小板活化指標(biāo)的影響
　　 2.1 ox-LDL促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的血小板聚集
　　 2.1.1在未使用阿司匹林阻斷TXA2生成的情況下：單純ox-LDL不能引起血小板聚集；當(dāng)ox-LDL與ADP同時加入血小板懸液時，ox-LDL未能促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率；當(dāng)用60μg/ml的ox-LDL與血小板預(yù)先孵育5min時，可明

21、顯促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率(14％±1％vs34％±2％，p＜0.05)。
　　 2.1.2使用阿司匹林阻斷TXA2生成的情況下，ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率較未加阿司匹林時下降，且聚集的血小板很快發(fā)生解聚；但用60μg/ml的ox-LDL預(yù)先孵育血小板5min后，發(fā)現(xiàn)ox-LDL仍可促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的聚集(12％±2％vs18％±1％，p＜0.05)，且形成的聚集穩(wěn)定，不發(fā)生解聚反應(yīng)。
　　 2.2 ox-LDL

22、促進(jìn)血小板在纖維蛋白原表面的鋪展
　　 實驗組與對照組血小板均發(fā)生鋪展，在40倍物鏡下觀察發(fā)現(xiàn)實驗組未充分鋪展血小板(熒光較強(qiáng)且面積較小)較對照組減少；放大5倍后，實驗組和對照組各選取4個視野，每個視野選取鋪展面積較大的3個血小板，以photoshopCS4計算鋪展面積(以像素值表示)，比較兩組血小板鋪展面積，對照組vs實驗組為21646.83±2488.06 vs32197.33±9134.24，p＜0.05，表明ox-LDL

23、可以促進(jìn)血小板在纖維蛋白原表面的鋪展。
　　 2.3 ox-LDL促進(jìn)全血狀態(tài)下血小板GpⅡb/Ⅲa受體的活化
　　 以80μg/ml的ox-LDL預(yù)先與全血孵育后，可明顯增加血小板表面活化的GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物數(shù)目(38％±2％vs46.1％±1％，p＜0.05)，并且在不同時間點(30min、1h、2h)，隨著孵育時間的延長，血小板表面活化的GpⅡb/Ⅲa復(fù)合物數(shù)目呈增長趨勢。
　　 3.ox-LDL活化血小

24、板的具體機(jī)制探討
　　 3.1.ox-LDL未促進(jìn)血小板致密顆粒內(nèi)ADP的釋放
　　 在纖維蛋白原(Fib)存在的情況下，用ADP刺激血小板時，蟲熒光素-熒光素酶標(biāo)記的ATP曲線明顯上升，表明血小板致密顆粒內(nèi)容物釋放，從而引起血小板的二相聚集；不加Fib的情況下，用ox-LDL預(yù)先孵育血小板5min，ADP刺激的ATP曲線未上升，且沒有明顯的二相聚集發(fā)生，表明ox-LDL不能促進(jìn)致密顆粒內(nèi)ADP的釋放。
　　 3

25、.2 ox-LDL對P2Y12受體下游信號的影響
　　 3.2.1 ox-LDL對血小板內(nèi)cAMP水平無影響
　　 以公式{[3H]cAMP/([3H]ATP+[3H]cAMP)x103}計算自ATP轉(zhuǎn)換的cAMP，發(fā)現(xiàn)ox-LDL并未使ADP誘導(dǎo)的cAMP水平發(fā)生明顯變化(3.88±0.01 vs4.02±0.78，p＞0.05)，且預(yù)先使用P2Y12受體特異性拮抗劑ARC69931MX阻斷ADP作用后，cAMP水平明

26、顯上升，但是ox-LDL對cAMP水平無明顯影響(9.90±2.11 vs11.62±0.20，p＞0.05)。
　　 3.2.2 ox-LDL對磷酸化的VASP無影響
　　 在未使用阿司匹林阻斷TXA2生成的情況下，ox-LDL預(yù)先與血小板孵育5分鐘未能影響磷酸化的VASP水平(以photoshop計算實驗組與對照組的電泳條帶灰度值，2477±0.28 vs21.45±1.73，p＞005)，說明ox-LDL對VASP

27、的水平無影響。
　　 3.2.3 ox-LDL可增加磷酸化Akt的水平
　　 經(jīng)ox-LDL預(yù)先孵育5min后，實驗組血小板內(nèi)磷酸化的Akt條帶較對照組明顯增寬(以photoshop計算條帶面積2139.00±320.58 vs553.33±165.13，p＜0.05)；使用阿司匹林阻斷TXA2生成后的結(jié)果類似；在使用ARC69931MX阻斷P2Y12受體的情況下，用ox-LDL預(yù)先孵育血小板5min，并使用TXA2激活

28、血小板，Akt的磷酸化未被阻斷(3588.50±239.71 vs345650±736.10，p＞0.05)，表明ox-LDL對Akt磷酸化的增強(qiáng)作用不受ARC69931MX的影響且與P2Y12受體無關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1.ox-LDL可明顯增強(qiáng)血小板的活性，表現(xiàn)在可促進(jìn)ADP誘導(dǎo)的血小板最大聚集率的升高、促進(jìn)血小板在纖維蛋白原表面的鋪展、活化血小板表面的GpⅡb/Ⅲa受體；
　　 2.ox-LDL促進(jìn)血小