人參皂苷Rd對(duì)氧化低密度脂蛋白活化肝星狀細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、肝纖維化是肝臟對(duì)各種致病因素導(dǎo)致的急性或慢性損傷進(jìn)行的可逆性修復(fù)過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起到至關(guān)重要的作用，表現(xiàn)為HSCs由靜止?fàn)顟B(tài)被激活并轉(zhuǎn)分化為肌成纖維樣細(xì)胞，隨后肌成纖維樣細(xì)胞大量增殖并過度合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，T

2、GF-β1）是最重要的致纖維化細(xì)胞因子，TGF-β1不但可以直接激活HSCs引起Ⅰ型膠原及其他基質(zhì)組分合成增加，還可以通過TGF-β/Smad信號(hào)通路促進(jìn)ECM的生成和沉積，使肝細(xì)胞受損后不能再生。
　　CD36屬于B族清道夫受體，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的多種細(xì)胞表面廣泛表達(dá)，介導(dǎo)長(zhǎng)鏈脂肪酸(fatty acids，F(xiàn)A)的攝取。CD36在正常肝內(nèi)皮和間質(zhì)細(xì)胞及庫(kù)弗氏細(xì)胞中低表達(dá)，但是可以在禁食或某些轉(zhuǎn)錄因子被激活時(shí)被誘導(dǎo)高表達(dá)，從而增加

3、肝臟對(duì)脂肪酸的攝取和甘油三酯的聚集。
　　自噬參與HSCs激活，通過分解受損細(xì)胞器，自噬可以為HSCs活化提供能量，促進(jìn)HSCs的活化及纖維化的發(fā)展;自噬還能夠通過分解肝細(xì)胞內(nèi)脂滴參與脂質(zhì)代謝，從而減輕肝臟炎癥。
　　人參皂苷Rd(Ginsenoside Rd)為人參提取物中的稀有單體皂苷，有很強(qiáng)的生物學(xué)活性，在保護(hù)心腦血管、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)及創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮獨(dú)到的藥理學(xué)作用。但人參皂苷Rd是否具有抗纖維化作用還鮮有研究。

4、為此，本研究采用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)活化HSCs為模型，探討人參皂苷Rd在肝纖維化中的作用及其相關(guān)機(jī)制，為人參皂苷Rd成藥提供思路。
　　方法:
　　1.MTT法檢測(cè)人參皂苷Rd對(duì)HSCs活力和增殖的影響
　　96孔板中接種細(xì)胞，每組6個(gè)復(fù)孔。12小時(shí)后加藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后加入MTT工作液，再繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加入DMSO終止液，搖勻后492nm測(cè)吸光度值。
　　2.ox-LDL活化H

5、SCs
　　完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞株HSC-T6，待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶底面積80％時(shí)，消化細(xì)胞并接種24孔板，12小時(shí)后加入10μg/ml ox-LDL，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組及加藥處理
　　實(shí)驗(yàn)分為4組:空白對(duì)照組、模型組、低劑量組、高劑量組;按照每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞接種12孔板，12小時(shí)后按上述分組依次加入PBS、10μg/ml ox-LDL、10μg/mlox-LDL+20μmol/L Rd、10μg/

6、ml ox-LDL+40μmol/L Rd，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
　　4.膽固醇氧化酶終點(diǎn)法檢測(cè)HSCs總膽固醇含量
　　細(xì)胞培養(yǎng)及加藥處理后，離心收集細(xì)胞沉淀并分成兩份，采用RIPA裂解液提取總蛋白和異丙醇加超聲提取總膽固醇;采用BCA法測(cè)定蛋白總濃度，使用膽固醇(CHO酶法)試劑盒測(cè)定總膽固醇含量;以各分組細(xì)胞總膽固醇/各分組細(xì)胞總蛋白(mg/g)作為各分組細(xì)胞總膽固醇含量的比較。
　　5.油紅染色法觀察HSCs脂質(zhì)

7、攝入
　　孔板中細(xì)胞爬片及加藥處理，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，去離子水洗片，加入油紅工作液避光染色，60％異丙醇漂洗后去離子水洗凈，顯微鏡下觀察拍照。
　　6.免疫熒光檢測(cè)HSCs膠原蛋白表達(dá)
　　孔板中細(xì)胞爬片及加藥處理，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，免疫染色封閉液室溫封閉，滴加Anti-CollagenⅠ抗體后于保濕盒中4℃避光孵育過夜;加入FITC標(biāo)記羊抗兔IgG，室溫避光孵育后DAPI染色，避光漂洗后加入抗熒光淬滅封片液，

8、倒置熒光顯微鏡觀察拍照。
　　7.RT-PCR法檢測(cè)HSCs mRNA表達(dá)
　　總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA總濃度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA;Real-time PCR檢測(cè)TGF-β1和CD36mRNA表達(dá);使用大鼠GAPDH作為內(nèi)參，以2-△△Ct法計(jì)算各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
　　8.Western blot檢測(cè)HSCs蛋白表達(dá)
　　RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白總濃度。

9、SDS-PAGE分離樣品蛋白后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5％脫脂奶粉室溫封閉，4℃過夜孵育各蛋白抗體:CD36，collagen typeⅠ(COL1A1)，Smad2，Smad4，LC3Ⅱ，GAPDH;室溫孵育二抗工作液;使用ECL發(fā)光液顯影并曝光膠片，Quantity One分析軟件進(jìn)行條帶灰度分析，各目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值作為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參皂苷Rd在濃度低

10、于40βM時(shí)對(duì)HSCs活力無影響;模型組的HSCs在培養(yǎng)24小時(shí)后略有增殖，但與空白對(duì)照組比較沒有明顯差異;低劑量組和高劑量組顯著抑制HSCs增殖(p＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;培養(yǎng)48小時(shí)后，模型組細(xì)胞增殖明顯上升(p＜0.05)，而低劑量組和高劑量組明顯抑制HSCs增殖（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01），與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.ox-LDL在10μg/ml時(shí)最大限度地持續(xù)活化HSCs，使

11、其TGF-31mRNA表達(dá)和COL1A1蛋白表達(dá)顯著上升(TGF-β1:P＜0.01;COL1A1:P＜0.05)，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.酶法檢測(cè)HSCs總膽固醇含量結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量顯著升高(P＜0.01)，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;人參皂苷Rd處理后，低劑量組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化不明顯，而高劑量組細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量明顯降低(P＜0.05)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.油紅染色結(jié)果

12、顯示，ox-LDL處理HSCs后，模型組細(xì)胞內(nèi)脂滴蓄積，脂滴數(shù)量和含量均明顯高于空白對(duì)照組;人參皂苷Rd處理后，與模型組比較，低劑量組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量略有減少，而高劑量組細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量顯著減少。
　　5.免疫熒光染色結(jié)果顯示，模型組表達(dá)COL1A1蛋白的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度均明顯高于空白對(duì)照組;人參皂苷Rd處理后，與模型組比較，低劑量組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度稍有降低，而高劑量組表達(dá)COL1A1蛋白的細(xì)胞數(shù)量和熒光強(qiáng)度均顯著降低。
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13、.HSCs活化后，模型組CD36mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，與空白對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低劑量組和高劑量組的CD36mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，與空白對(duì)照組和模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　7.ox-LDL活化HSCs后，模型組COL1A1蛋白、CD36蛋白、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯升高(COL1A1:P＜0.05;CD36:P＜0.01;LC3Ⅱ:P＜0.05)，與空白對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組Smad

14、2蛋白表達(dá)略有下降，Smad4蛋白表達(dá)有所增加，與空白對(duì)照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。人參皂苷Rd處理后，低劑量組和高劑量組COL1A1蛋白表達(dá)均明顯降低（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01），與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低劑量組CD36蛋白改變不明顯，而高劑量組CD36蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低劑量和高劑量組Smad2蛋白表達(dá)均無明顯改變，但高劑量組Samd4蛋白表達(dá)顯著降低(p＜0.01)，與

15、模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低劑量組和高劑量組LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯降低（低劑量組:P＜0.05;高劑量組:P＜0.01)，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.低濃度ox-LDL可以持續(xù)活化HSCs，使HSCs TGF-β1mRNA表達(dá)和COL1A1蛋白表達(dá)顯著升高。
　　2.人參皂苷Rd可能通過抑制CD36蛋白表達(dá)及減少脂質(zhì)攝入來抑制活化的HSCs增殖和COL1A1蛋白表達(dá)而具有抗纖維化的作用。
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