HLA-B27基因多態(tài)性在中國AS患者分布特點和HLA-B-2715等位基因致病相關機制的研究.pdf

1、第一部分中國幼年及成年強直性脊柱炎患者HLA-B27多態(tài)性分布特點研究
　　 背景：強直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種具有高度遺傳性的常見風濕性疾病，主要侵犯脊柱和骶髂關節(jié)，致殘率高，人群發(fā)病率約0.3％。AS與HLA-B27強相關。已證實因遺傳因素和地理位置的差異，B27亞群在各種族人群中分布不同。在中國大陸，有關B27等位基因在AS患者中的分布還沒有大型的研究。
　　 目的：研究

2、中國漢族幼年及成年強直性脊柱炎患者HLA-B27亞型分布情況，并分析此兩種臨床類型患者的B27亞型分布是否存在差異。
　　 方法：AS患者共505例，來自2005年1月-2008年12月本院風濕科門診及病房，為中國漢族人群，16歲以下起病者為幼年強直性脊柱炎(JAS)，共145例，16歲以上起病者為成年強直性脊柱炎(AAS)，共360例?；颊邼M足1984年修訂的強直性脊柱炎紐約診斷標準。與JAS組及AAS的年齡、性別相匹配的健康

3、志愿者對照組共1368例，其中匹配JAS對照組156例，匹配AAS對照組1212例。鹽析法提取基因組DNA。用Luminex液態(tài)芯片，結(jié)合PCR-SSOP技術對HLA-B位點做低分辨分型(AccuPlexTM，Dynal-Invitrogen，美國)。部分標本用血清學方法(微量淋巴細胞毒法)檢測HLA-B27抗原。HLA-B27陽性者進一步用PCR-SSP方法做高分辨B27亞型檢測(Dynal-Invitrogen，美國)。PCR-SS

4、P法分型為HLA-B*2715的樣本再行直接測序分型，驗證結(jié)果。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.AS患者505例中，B27陽性453例，總陽性率89.7％，而1368例健康對照中B27陽性74例，總陽性率5.41％，二者差異有顯著性(P<0.001)。
　　 2.HLA-B*2704在AS組顯著高于對照組(P<0.001)；而B*2705顯著低于對照組(P<0.001)；B*2

5、715和B*2702在B27陽性患者組中分別占1.32％和0.66％，而對照組均為0，但與對照組問無顯著差異(P均>0.05)。
　　 3.JAS組出現(xiàn)3種亞型(B*2704、B*2705和B*2715)，AAS組出現(xiàn)4種亞型(B*2704，B*2705，B*2715和B*2702)，兩組B27亞群分布無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。
　　 4.攜帶B*2715等位基因的有三例JAS和3例AAS患者，其中JAS的起病年齡

6、分別為5、9、13歲。
　　 5.共5個B27亞型出現(xiàn)于健康對照人群(B*2704，05，03，06和07)，與JAS和AAS匹配的兩個健康志愿者對照組各亞群間無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.HLA-B*2704是中國JAS和AAS患者的主要亞型，與AS相關。
　　 2.HLA-B27亞型分布在JAS和AAS患者兩組間無顯著性差異。
　　 3.HLA-B*2715作為HL

7、A-B27罕見亞型，只發(fā)現(xiàn)于AS患者，是潛在的參與AS致病相關的HLA-B27亞型。
　　 第二部分幼年AS患者HLA-B27各亞型臨床表現(xiàn)及B27等位基因致病機制初步研究
　　 --不同HLA-B27亞型患者MMP-3、sRANKL和OPG變化及意義
　　 背景：癥狀出現(xiàn)于16歲以前的強直性脊柱炎定義為幼年強直性脊柱炎(JAS)，占AS的10％-20％。JAS臨床表現(xiàn)與成人AS不同，而B27亞型與臨床表現(xiàn)的關系

8、在成人已有較多報道，在JAS中有待更多研究。研究顯示JAS功能預后可能更差，而近年AS患者骨丟失、骨質(zhì)疏松的狀況受到重視，研究JAS中是否有骨代謝的異常及骨代謝相關因子與炎癥因子的關系，對臨床診治、改善預后有積極意義。
　　 目的：1.在第一部分B27基因分型的基礎上，探討JAS和AAS患者B27不同亞型間臨床表現(xiàn)的差異及JAS組內(nèi)各亞型臨床表現(xiàn)的差異；2.檢測JAS組患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)、可溶性核因子NF-

9、kB受體活化因子配體(sRANKL)和骨保護素(OPG)水平，探討各指標與JAS臨床特征的相關性及不同亞型患者問血清水平有否差異。
　　 方法：JAS組患者145例，其中檢測MMP-3、sRANKL和OPG的患者分別為56例、62例和68例。AAS組患者360例。血清學檢查健康志愿者對照組32例。同時收集患者病史、體檢、強直性脊柱炎疾病活動指數(shù)(BASDAI)、功能指數(shù)(BASFI)及實驗室檢查資料。應用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELI

10、SA)檢測JAS患者和健康志愿者血清MMP-3、sRANKL和OPG水平，并與臨床指標進行相關分析。
　　 結(jié)論：
　　 1.JAS臨床特征與AAS有差異，JAS男性比例、肌腱端炎及髖受累更多見，尤其髖受累者預后較差，臨床應積極治療，減少殘疾。
　　 2.JAS組B*2704、05和15亞型問臨床特征、MMP-3、sRANKL及OPG的變化無明顯差異。
　　 3.JAS患者中sRANKL表達顯著增高，提示

11、患者有破骨代謝增強，在JAS患者的診治中應關注骨代謝異常的情況。
　　 第三部分 AS患者HLA-B*2715等位基因致病相關機制的初步探討
　　 第一章一個HLA-B*2715的AS家系患者臨床特點、全基因組SNPs連鎖分析和血清MMP-3、sRANKL和OPG變化及意義探討
　　 背景：強直性脊柱炎(AS)是一種主要侵犯中軸關節(jié)及外周大關節(jié)的慢性進行性炎癥性疾病。通過分子遺傳學技術，對AS的家系、孿生子和病例

12、-對照進行研究，證實AS足以B27為主要易感基因的多基因遺傳病。單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism，SNP)是繼限制性片段長度多態(tài)性和微衛(wèi)星多態(tài)性這兩種遺傳標記后的第三代遺傳標記，在復雜疾病的遺傳學研究中成為新的研究工具。HLA-B*2715是出現(xiàn)于亞洲的罕見B27亞型，對一攜帶此基因的AS家系，進行臨床、免疫學及SNPs研究，有助于探討此等位基因與AS的相關性及其致病機制。
　　 目的

13、：通過收集家系臨床資料、對成員的B*2715基因進行SNPs掃描分析及檢測炎癥及骨代謝指標，探討此亞型的特征，以助揭示AS的發(fā)病機制。。
　　 方法：收集14位家系成員臨床資料；用含620901個SNPs的高密度基因芯片HumanHap610-quad chip在Illumina Infinium arrays上對患者B*2715基因進行SNPs分型；用ELISA方法檢測13例成員血清MMP-3、sRANKL和OPG水平。

14、>　　 結(jié)論：
　　 1.本家系攜帶B*2715的成員AS發(fā)病率高，提示B*2715是與AS相關的亞型。
　　 2.雖然B*2715基因SNP的LOD值小于1,因本家系樣本只有7例，不能排除B*2715是AS的易感基因，需繼續(xù)積累病例驗證。
　　 第二章 HLA-B*2715基因真核細胞慢病毒表達載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　 背景：強直性脊柱炎(AS)是一種具高度遺傳性的疾病。1973年發(fā)現(xiàn)HLA-B27與A

15、S的強相關以來，許多證據(jù)表明B27直接參與了發(fā)病，認為B27分子是AS的原發(fā)關聯(lián)成分。HLA-B27具有多個亞型，B2705分布最廣，是祖先亞型，研究認為其他亞型是由B*2705基因發(fā)生突變、移位或其他機制形成。因此，大多數(shù)對B27亞型的基礎研究都是圍繞B*2705進行。目前被認為與AS致病密切相關的亞型主要有B*2702、B*2704、B*2705等。見于亞洲的B*2706可能是一種保護性基因，而亞洲的另一基因B*2715，因出現(xiàn)頻率

16、低和發(fā)現(xiàn)時間短，研究結(jié)果較少，與AS之間的關系尚不清楚，本課題前期研究顯示攜帶此基因的散發(fā)患者發(fā)病時間早，而家系成員AS發(fā)病率高，提示可能是與AS相關的亞型，故將此基因的克隆載體轉(zhuǎn)入單核細胞系，體外研究其功能，將有助于探討B(tài)*2715與AS的相關性及致病機制。
　　 目的：構(gòu)建HLA-B*2715慢病毒載體，轉(zhuǎn)染U937細胞系，建立穩(wěn)定表達B*2715基因的細胞，以研究該基因的功能。
　　 方法：全基因合成法合成HLA-

17、B*2715 cDNA序列，構(gòu)建pUC57-B*2715質(zhì)粒載體(用于保存cDNA)，酶切及測序鑒定；構(gòu)建PL-B*2715-GFP目的穿梭質(zhì)粒載體，酶切鑒定；在293T細胞中進行慢病毒包裝(四質(zhì)粒系統(tǒng)，其中目的穿梭質(zhì)粒含有能表達綠色熒光蛋白的GFP基因)；慢病毒轉(zhuǎn)染U937細胞(單核細胞系)及對照細胞293T細胞，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達。
　　 結(jié)果：pUC57-B*2715載體及PL-B*2715-GFP目的穿梭質(zhì)